背景^[1-3]

SW1990人胰腺癌細(xì)胞是1978年從胰腺外分泌腺的胰腺腺癌II期患者的脾轉(zhuǎn)移灶中建立的細(xì)胞株。

細(xì)胞培養(yǎng)步驟

培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備L15培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2）培養(yǎng)條件：氣相：空氣，100%。溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3） 傳代方法：

4） 1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

5） 2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

6） 3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

7） 4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

應(yīng)用^[4][5]

用于蛋白酶激活受體2在人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用研究

采用侵襲轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)的人胰腺癌細(xì)胞株SW1990為靶細(xì)胞,初步探討PAR-2促進(jìn)胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的可能的分子機(jī)制。

方法:RT-PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測SW1990細(xì)胞中PAR-2 mRNA及蛋白的表達(dá)情況。繪制SW1990細(xì)胞生長曲線,MTT法檢測胰蛋白酶和PAR-2激動肽SLIGKV作用前后SW1990細(xì)胞增殖情況,并確定合適的各藥物濃度和作用時間。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期分布。Transwell小室法檢測各組細(xì)胞侵襲和遷移能力。RT-PCR法檢測胰藥物作用前后MMP-2、MMP-9、VEGF-A、VEGF-C、IL-8 mRNA表達(dá)的變化。

明膠酶譜法檢測胰蛋白酶和SLIGKV作用細(xì)胞前后MMP-2、MMP-9明膠酶活性的變化。ELISA法檢測藥物干預(yù)SW1990細(xì)胞8h、16h、24h、32h后分別收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清液,檢測各組細(xì)胞相對應(yīng)的各個時間段上清液中VEGF-A、VEGF-C及IL-8的蛋白含量變化。結(jié)果:PAR-2在胰腺癌細(xì)胞SW1990細(xì)胞中高表達(dá)。

參考文獻(xiàn)

[1]The Akt expression correlates with the VEGF-A and-C expression as wellas the microvessel and lymphatic vessel density in breast cancer[J].Shinichi Tsutsui,Ayumi Matsuyama,Manabu Yamamoto,Hideya Takeuchi,Yumi Oshiro,Teruyoshi Ishida,Yoshihiko Maehara.Oncology Reports.2010(3)

[2]Dual effect of the novel peptide antagonist K‐14585 on proteinase‐activated receptor‐2‐mediated signalling[J].Fui GoonGoh,Pei YuenNg,MaryNilsson,ToruKanke,RobinPlevin.British Journal of Pharmacology.2009(7)

[3]Vascular Endothelial Growth Factors,Angiogenesis,and Survival in Human Ileal Enterochromaffin Cell Carcinoids[J].Besig,Sophie,Voland,Petra,Baur,Dorothee M,Perren,Aurel,Prinz,Christian.Neuroendocrinology.2009(4)

[4]Novel antagonists for proteinase‐activated receptor 2:inhibition of cellular and vascular responses in vitro and in vivo[J].TKanke,MKabeya,SKubo,SKondo,KYasuoka,JTagashira,HIshiwata,MSaka,TFuruyama,TNishiyama,TDoi,YHattori,AKawabata,MRCunningham,RPlevin.British Journal of Pharmacology.2009(1)

[5]段澤星.蛋白酶激活受體2在人胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用研究[D].河北醫(yī)科大學(xué),2011.