背景[1-3]
HT-1080人纖維肉瘤細胞來源于一位35歲男人的纖維肉瘤及結(jié)締組織的纖維肉瘤細胞，細胞形態(tài)為上皮細胞樣貼壁生長，HT-1080細胞含有活化的N-ras癌基因。
細胞處理：
1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
傳代方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3ml此細胞的培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打后吸出，移入15ml離心管中，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.移入到事先準備好的含有5ml培養(yǎng)基的T-25培養(yǎng)瓶中或含有14ml培養(yǎng)基的T-75培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，先要消化處理并進行細胞計數(shù)。消化方法按照細胞傳代方法的1-3步驟進行，最后的重懸液使用血清。懸浮細胞直接計數(shù)后離心，用血清重懸浮，加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻，按每1ml的數(shù)量分配到凍存管中。
應用[4][5]
用于雷公藤內(nèi)酯醇對人纖維肉瘤HT-1080細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達的影響及其機制研究
研究雷公藤內(nèi)酯醇（TL）對人纖維肉瘤HT-1080細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）表達的影響。
方法1.選擇人纖維肉瘤細胞系HT-1080為研究對象,常規(guī)培養(yǎng)、傳代,藥物的3個工作濃度分別為6nM、12nM和18nM,處理時間均為72小時;
2. 采用MMT法檢測TL對HT-1080細胞增殖能力的影響;
3. 用流式細胞儀檢測TL致HT-1080細胞凋亡情況;
4. 運用RT-PCR檢測TL對9個基因mRNA表達的影響,這些基因是:MMP-9和-2,基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物（TIMP）-1、-2、-3和-4,DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）-1、-3A和-3B;
5. 用明膠酶譜實驗檢測TL對HT-1080細胞MMP-9和-2活性的影響;
6. 用Transwell侵襲實驗檢測TL對HT-1080細胞體外侵襲能力的影響;
7.用甲基化特異性PCR（MSP）檢測TL對MMP-9基因甲基化水平的影響;8.用Western blotting檢測TL對DNMT-1、-3A和-3B蛋白表達的影響。
結(jié)果1.TL作用72小時,隨藥物濃度的增加,HT-1080細胞的增殖逐漸受到抑制;其中,半數(shù)抑制濃度約為25nM;
2. 濃度分別為6 nM、12 nM和18 nM的TL處理72小時后,HT-1080細胞的凋亡率分別為16.0%、17.3%和18.8%,對照組凋亡率為17.7%;
3.18 nM TL處理HT-1080細胞72小時后,MMP-9 mRNA的表達明顯下調(diào)（P＜0.05）,但MMP-2、TIMP-1/-2/-3/-4 mRNA的表達無明顯變化（P均＞0.05）;6 nM和12 nM TL處理組上述基因的mRNA表達均無明顯變化（P均＞0.05）;
4.12 nM TL處理HT-1080細胞72小時后,在細胞無血清培養(yǎng)基上清中檢測到的MMP-9的活性明顯下調(diào)（P＜0.05）,18 nM TL處理組無血清培養(yǎng)基上清中則基本檢測不到MMP-9（P＜0.01）;3個藥物處理組MMP-2的活性均無明顯變化（P均＞0.05）。
參考文獻
[1]The other side of MMPs:Protective roles in tumor progression[J].Michelle D.Martin,Lynn M.Matrisian.Cancer and Metastasis Reviews.2007(3)
[2]The Effect of Triptolide on Apoptosis of Glioblastoma Multiforme(GBM)Cells[J].J Lin,L-Y Chen,Z-X Lin,M-L Zhao.Journal of International Medical Research.2007(5)
[3]Sulfated glucosamine inhibits MMP-2 and MMP-9 expressions in human fibrosarcoma cells[J].Niranjan Rajapakse,Eresha Mendis,Moon-Moo Kim,Se-Kwon Kim.Bioorganic&Medicinal Chemistry.2007(14)
[4]Methods for detecting DNA methylation in tumors:From bench to bedside[J].David S.Shames,John D.Minna,Adi F.Gazdar.Cancer Letters.2007(2)
[5]楊盛波.雷公藤內(nèi)酯醇對人纖維肉瘤HT-1080細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達的影響及其機制研究[D].中南大學,2008.