背景[1-3]
單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增試劑盒基于多重鏈置換擴(kuò)增的Phi29 DNA聚合酶等溫?cái)U(kuò)增體系，Phi29 DNA聚合酶是從Bacillus subtilis噬菌體Phi29中克隆出的嗜溫DNA聚合酶，利用基因重組技術(shù)，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)后經(jīng)多次純化分離而得。Phi29 DNA聚合酶具有很強(qiáng)的鏈置換活性，可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA復(fù)雜結(jié)構(gòu)的解鏈與復(fù)制。同時(shí)具有高效的DNA合成能力，可連續(xù)合成多達(dá)70kb的DNA片段。Phi29 DNA聚合酶具有很強(qiáng)的3’→5’外切酶活性，保真度高于絕大多數(shù)高保真酶，因此Phi29 DNA聚合酶特別適合用于全基因組擴(kuò)增。
單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增
本試劑盒可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞或者少量樣本的全基因組無(wú)差別擴(kuò)增，一個(gè)反應(yīng)可以達(dá)到40ug的全基因組DNA。低質(zhì)量樣品會(huì)影響DNA的最終產(chǎn)量，如果以DNA樣品為模板，需避免使用降解的DNA作為起始模板。
操作步驟：
適用于以1-1000個(gè)新鮮配制的細(xì)胞樣品作為模板，以保證起始基因組的完整性。
1、將細(xì)胞用PBS洗滌三次。
2、取一倍體積的細(xì)胞，加入一倍體積的Cell Lysis Buffer，輕輕混勻（勿渦旋混勻）后置于冰上放置10min。
3、加入一倍體積的Neutralization Buffer，輕輕混勻，勿渦旋混勻。
4、從上述混合液中取3μL樣品，加入7μL無(wú)菌水，10μL Reaction Buffer。將20uL上述處理后的樣品加入到25uL GenoPhi29 Buffer中。
注意：如果不進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，需冰上放置。
5、加入5μL GenoPhi29 Enzyme，30℃反應(yīng)3h。
注意：65℃，10min失活Phi29 DNA聚合酶。
6、擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度基因組DNA，需要將擴(kuò)增產(chǎn)物用無(wú)菌水或者TE緩沖液進(jìn)行稀釋后進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。
應(yīng)用[4][5]
用于基于單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)基因點(diǎn)突變與染色體拷貝數(shù)變異的高通量測(cè)序方法的建立與評(píng)估
通過(guò)活檢廢棄卵裂球胚胎結(jié)合分離外周血單個(gè)白細(xì)胞,進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增。研究高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法對(duì)DNA高通量測(cè)序測(cè)序覆蓋度、敏感性、特異性等的影響;研究不同測(cè)序深度及獲取數(shù)據(jù)量對(duì)DNA高通量測(cè)序測(cè)序覆蓋度、敏感性、特異性等的影響;建立基于單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增的基因點(diǎn)突變及染色體拷貝數(shù)變異的高通量測(cè)序方法,優(yōu)化單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物高通量測(cè)序流程。
方法:在體視鏡下分離已知致病突變位點(diǎn)的β地中海貧血患者外周血單個(gè)白細(xì)胞、活檢廢棄卵裂球胚胎。隨后進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增,以單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物作為模板,對(duì)HBB基因目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
采用兩種方法構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù):（1）單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物按1:99;3:97;5:95及10:90的比例混合后,再構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù);
（2）單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物及PCR產(chǎn)物分別構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù),兩種測(cè)序文庫(kù)按1:99;3:97;5:95及10:90的比例混合。0.1×、2×測(cè)序深度下進(jìn)行高通量測(cè)序。通過(guò)比較各檢測(cè)方案的目標(biāo)致病突變檢測(cè)效率、染色體覆蓋深度與覆蓋率、染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)的均一性,建立并優(yōu)化基于單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增的同時(shí)檢測(cè)基因點(diǎn)突變與染色體拷貝數(shù)變異的高通量測(cè)序方法。
用5例已知致病突變位點(diǎn)的β地中海貧血患者外周血單個(gè)白細(xì)胞和5例廢棄卵裂球胚胎對(duì)所建立的方法進(jìn)行擴(kuò)大驗(yàn)證。
結(jié)果:所有檢測(cè)方案對(duì)目標(biāo)致病突變檢測(cè)的靈敏度和特異性均為100%。
參考文獻(xiàn)
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