背景^[1-3]

WI-38人胚肺細(xì)胞是來自妊娠3個(gè)月的正常胚胎肺組織。WI-38細(xì)胞是首株用于人類疫苗制備的人二倍體細(xì)胞系，培養(yǎng)液中添加TNF-α可以促進(jìn)WI-38細(xì)胞生長(zhǎng)。

WI-38人胚肺細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1、對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

應(yīng)用^[4][5]

用于Cryptococcus heimaeyensis S20胞外多糖CHEPS誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞死亡及分子機(jī)制研究

CHEPS能夠有效抑制NSCLC細(xì)胞活性,而對(duì)正常的人胚肺成纖維細(xì)胞WI-38和MRC-5的抑制效果較弱。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),CHEPS通過上調(diào)周期調(diào)控蛋白p53和p21的表達(dá)以及下調(diào)Cyclin B1、CDK1、Cyclin A2和CDK2的表達(dá),有效誘導(dǎo)了NSCLC細(xì)胞的S和G2/M期停留。而CHEPS在WI-38細(xì)胞中誘導(dǎo)的S和G2/M期停留效果不如在NSCLC細(xì)胞中明顯。

此外,CHEPS不通過細(xì)胞凋亡通路來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,表現(xiàn)為不能誘導(dǎo)細(xì)胞磷脂酰絲氨酸外翻和凋亡標(biāo)志蛋白Bax的上調(diào)以及Caspase 3、PARP等蛋白的剪切。通過EGFP-LC3熒光點(diǎn)聚集實(shí)驗(yàn)、LC3轉(zhuǎn)換和周轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)、電鏡實(shí)驗(yàn)以及對(duì)自噬相關(guān)基因的m RNA和蛋白水平的檢測(cè),我們證實(shí)CHEPS可以誘導(dǎo)NSCLC和WI-38細(xì)胞自噬潮的發(fā)生。

細(xì)胞自噬早期抑制劑3-MA處理和通過sh RNA干擾自噬基因ATG5的蛋白表達(dá)均能部分拯救CHEPS誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞死亡,而3-MA卻不能有效回復(fù)CHEPS誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞的死亡。這些結(jié)果表明CHEPS誘導(dǎo)了NSCLC細(xì)胞自噬性細(xì)胞死亡。雖然CHEPS誘導(dǎo)了WI-38細(xì)胞自噬,但自噬并不導(dǎo)致WI-38細(xì)胞死亡。

PI3K/AKT、AMPK、MAPK是三個(gè)調(diào)控細(xì)胞自噬的重要信號(hào)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CHEPS不能抑制AKT的磷酸化激活,說明CHEPS不通過PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)自噬發(fā)生。CHEPS激活了AMPK信號(hào),但激活的AMPK并不能激發(fā)NSCLC細(xì)胞自噬和死亡。CHEPS誘導(dǎo)了MAPK通路中的p38、ERK、JNK磷酸化激活,其中p38和ERK有效促進(jìn)了CHEPS誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞死亡,抑制p38和ERK后部分拯救了CHEPS誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞死亡。

CHEPS不能有效激活WI-38細(xì)胞中的MAPK信號(hào)通路。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明,ERK的磷酸化激活促進(jìn)了CHEPS誘導(dǎo)的S和G2/M期停留。p38和ERK均能促進(jìn)CHEPS誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞自噬,它們的抑制劑和RNA干擾實(shí)驗(yàn)部分下調(diào)了CHEPS誘導(dǎo)的LC3-II蛋白的表達(dá)。

誘導(dǎo)活性氧（ROS）的積累是一些化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的重要分子機(jī)制。CHEPS處理可導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生,ROS的清除劑NAC能部分抑制CHEPS誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞中p38和ERK的磷酸化水平、細(xì)胞自噬和細(xì)胞死亡,說明ROS的積累促進(jìn)了p38和ERK調(diào)控的自噬性細(xì)胞死亡。ROS對(duì)CHEPS誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞中S和G2/M期停留沒有影響。

CHEPS不能誘導(dǎo)WI-38細(xì)胞中ROS的積累。除了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),我們還建立了裸鼠A549肺癌細(xì)胞異種移植瘤模型,以研究CHEPS在體內(nèi)對(duì)肺癌細(xì)胞的影響。100mg/kg的CHEPS在動(dòng)物體內(nèi)能夠有效抑制A549移植瘤的生長(zhǎng),同時(shí)并不造成裸鼠體重減輕和肝、脾、肺、腎等主要臟器的器官毒性。

與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,在動(dòng)物體內(nèi),CHEPS也誘導(dǎo)了ROS的產(chǎn)生、激活了p38和ERK通路、激發(fā)了細(xì)胞自噬。我們的研究首次從體內(nèi)外證明了隱球酵母Cryptococcus heimaeyensis S20胞外多糖CHEPS在非小細(xì)胞肺癌中的抗腫瘤活性,并且探討了潛在的機(jī)制。CHEPS通過激活ROS/p38/ERK信號(hào),有效誘導(dǎo)了NSCLC細(xì)胞中的S和G2/M期停留和自噬性細(xì)胞死亡。

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