概述^【1】

魯米諾是一類氨基鄰苯酰肼類物質(zhì)，是最早在CLIA中使用的一種常見(jiàn)的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)。魯米諾在水溶液中的化學(xué)發(fā)光量子產(chǎn)率為1.0％～1.5％，發(fā)射光波長(zhǎng)為425 nm，利用氨基與其他化合物連接。早期用魯米諾直接標(biāo)記抗原或抗體，但當(dāng)它標(biāo)記到抗原或抗體分子上后，發(fā)光活性明顯降低，光子產(chǎn)率降為原來(lái)的10％，主要原因是標(biāo)記后產(chǎn)生空間位阻。

制備^【2】

制備原理：

3一硝基一鄰苯二甲酸(3-nitrophthalic acid)是制備化學(xué)發(fā)光劑魯米諾的原料，經(jīng)脫水后得到的3一硝基一鄰苯二甲酸酐可用于有機(jī)合成和醇類測(cè)定。鄰苯二甲酸酐經(jīng)直接硝化，既可獲得3一硝基一鄰苯二甲酸．同時(shí)也會(huì)得到4一硝基一鄰苯二甲酸。在3一硝基一鄰苯二甲酸分子中，硝基對(duì)鄰位羧基影響很大，它和羧酸會(huì)形成分子內(nèi)氫鍵，加上相鄰二羧基之問(wèn)存在的分子內(nèi)氫鍵，對(duì)整個(gè)羧酸分子的解離產(chǎn)生顯著的抑制作用，從而導(dǎo)致其水溶性下降。在4一硝基一鄰苯二甲酸中，硝基與羧酸之間難以形成分子內(nèi)氫鍵，因而，它在水中的解離度相對(duì)要大一些，水溶性也好一些。鄰苯二甲酸酐硝化后產(chǎn)生的異構(gòu)體正是利用它們?cè)谒苄陨系牟町惣右苑蛛x的。其反應(yīng)式如下：

許多化學(xué)反應(yīng)都是以熱的形式釋放能量，也有一些化學(xué)反應(yīng)主要是以光的形式釋放能量，魯米諾(1umino1)在堿性條件下與氧分子的作用就是一個(gè)典型的化學(xué)發(fā)光例子。一般認(rèn)為，魯米諾在堿性溶液中轉(zhuǎn)變?yōu)槎r(jià)負(fù)離子，后者與氧分子反應(yīng)生成一種過(guò)氧化物，過(guò)氧化物不穩(wěn)定而發(fā)生分解，導(dǎo)致形成一種具有發(fā)光性能的電子激發(fā)態(tài)中間體。其過(guò)程如下：

現(xiàn)已證實(shí)，發(fā)光體是3一氨基一鄰苯二甲酸鹽二價(jià)負(fù)離子的激發(fā)單線態(tài)。當(dāng)激發(fā)單線態(tài)返回至基態(tài)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生熒光。激發(fā)態(tài)中間體也可將能量傳遞至激發(fā)態(tài)能量較低的受體分子，受激發(fā)的受體分子再通過(guò)發(fā)出熒光釋放能量恢復(fù)到基態(tài)。不同受體分子的激發(fā)態(tài)能量的差異使其發(fā)出的熒光各不相同，這些現(xiàn)象在本實(shí)驗(yàn)中可觀察得到。

合成方法：

1．3一硝基一鄰苯二甲酸的合成

在100 mL三口燒瓶上，配置磁力攪拌器、溫度計(jì)、冷凝管和滴液漏斗，加12 mL濃硫酸和12 g鄰苯二甲酸酐。加熱并開(kāi)動(dòng)攪拌器，當(dāng)反應(yīng)混合物溫度升至80℃時(shí)停止加熱。將i0 mL發(fā)煙硝酸自滴液漏斗慢慢滴人燒瓶中，滴加速度以維持

反應(yīng)混合物溫度在100～110℃為宜。

加完硝酸后，繼續(xù)加熱并攪拌l h，溫度控制在100℃。然后，讓反應(yīng)液冷卻。在通風(fēng)櫥中將反應(yīng)液慢慢倒入盛有40 mL冷水的燒杯中。當(dāng)有固體析出時(shí)，傾去酸液，再向燒杯中加入10 mL水，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，使副產(chǎn)物4一硝基一鄰苯二甲酸溶于水。過(guò)濾，收集固體，即得到3一硝基一鄰苯二甲酸粗產(chǎn)物。

3一硝基一鄰苯二甲酸粗產(chǎn)物可用水重結(jié)晶，在重結(jié)晶時(shí)，每克粗產(chǎn)物約需2．3 mL的水。產(chǎn)物熔點(diǎn)為215～218℃。

2．魯米諾的合成

將1．3 g 3-硝基一鄰苯二甲酸和2 mL lO％水合肼置于100 mL二口燒瓶中，加熱溶解。然后加入4 mL二縮三乙二醇，將二口燒瓶固定在鐵架臺(tái)上，加入沸石，插入溫度計(jì)，用一導(dǎo)管將燒瓶通過(guò)安全瓶與水泵相連。打開(kāi)水泵，加熱燒瓶．瓶?jī)?nèi)反應(yīng)物劇烈沸騰，蒸出的水蒸氣由導(dǎo)管抽走。大約5 min后，溫度快速升至200℃以上。繼續(xù)加熱，使反應(yīng)溫度維持在210～220℃約2 min。打開(kāi)安全瓶上的活塞，使反應(yīng)體系與大氣相通，停止加熱和抽氣。讓反應(yīng)物冷卻至100℃，加入20 mL熱水(加熱后再冷卻，所獲粗產(chǎn)物容易過(guò)濾)，進(jìn)一步冷卻至室溫，過(guò)濾，收集淺黃色晶體，即得到5一硝基一鄰苯二甲酰肼中間體，中間體不需要干燥即可用于下一步的反應(yīng)。

將5一硝基一鄰苯二甲酰肼中間體轉(zhuǎn)入燒杯中，加入6．5 mL lo％氫氧化鈉溶液。用玻璃棒攪拌使固體溶解。加人4 g二水合連二亞硫酸鈉，然后加熱至沸并不斷攪拌，保持沸騰5 min。稍冷卻，加入2．6 mL冰乙酸，繼而在冷水浴中冷卻至室溫．有大量淺黃色結(jié)晶析出。抽濾，水洗3次，再抽干，收集終產(chǎn)物5一硝基一鄰苯二甲酰肼(魯米諾)。取少許樣品，干燥后測(cè)定熔點(diǎn)(熔點(diǎn)為319～320℃)。

發(fā)光反應(yīng)^【2】

在250 mL錐形瓶中．依次加入15 g氫氧化鉀、25 mL二甲亞砜和0．2 g未經(jīng)干燥的魯米諾，蓋上瓶塞，然后劇烈搖蕩，使溶液與空氣充分接觸。此時(shí)，在暗處就能觀察到從錐形瓶中發(fā)出的微弱藍(lán)色熒光。繼續(xù)搖蕩并不時(shí)地打開(kāi)瓶塞，讓新鮮空氣進(jìn)入瓶?jī)?nèi)，瓶中的熒光會(huì)變得越來(lái)越亮。

將不同熒光染料(1～5 mg)分別溶于2～3 mL水中，并加入魯米諾二甲亞砜溶液中，蓋上瓶塞，用力搖動(dòng)。在暗室里可以觀察到不同顏色的熒光。部分結(jié)果見(jiàn)下表。

參考文獻(xiàn)

[1]李天星，陳建明，蒲曉允，趙樹銘主編，現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù),軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2014.09，第18頁(yè)

[2] 何樹華，朱云云，陳貞干主編；田光輝，田春良，徐翠蓮等副主編，有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)，華中科技大學(xué)出版社，2012.08，第237頁(yè)