背景[1-3]
人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA KIT用于測定血清，血漿及相關(guān)液體樣本中表面活性蛋白A(SP-A)相關(guān)含量或活性。
原理：試劑盒采用間接法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被表面活性蛋白A(SP-A)捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的表面活性蛋白A(SP-A)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
人表面活性蛋白A(SP-A)ELISA KIT
實(shí)驗(yàn)原理
用純化的抗體包被微孔板,制成固相載體,往包被抗該指標(biāo)抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗該指標(biāo)抗體、HRP標(biāo)記的親和素,經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的該指標(biāo)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),計(jì)算樣品濃度。
操作步驟
1、取出試劑盒,室溫(20-25℃)放置30分鐘。
2、分組:取出96孔板,根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù),把剩余的板條繼續(xù)冷藏處理。10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔,1個(gè)空白對(duì)照
3、標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋:準(zhǔn)備小試管6只,依次編好號(hào)碼,先在各小試管中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液100ul,然后取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品100ul加入一只已編好號(hào)的試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第二支試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第三只試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第四只試管中,充分混勻;再在該試管中取100ul加入第五只試管中,充分混勻;然后在該試管中取100ul,棄掉。第六只試管作為0號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。
4、加樣:依照標(biāo)準(zhǔn)品的順序分別加入50ul的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中;空白對(duì)照孔加入50ul的蒸餾水;其余微孔中先加樣品40ul然后再加生物素標(biāo)記的抗體10ul。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動(dòng)混勻。
5、溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
6、洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒棄去,如此重復(fù)5次,拍干。
7、加酶標(biāo)溶液:標(biāo)準(zhǔn)品組、待測樣本組各孔中加入50ul的酶標(biāo)溶液(空白對(duì)照孔除外)。
8、溫育:酶標(biāo)板用封板紙密封后,放入濕盒內(nèi)于37℃恒溫孵育1小時(shí)。
9、洗板:用稀釋后的洗滌液注滿每孔,靜置15-30s,充分清洗酶標(biāo)板5次,用吸水紙徹底拍干。
10、顯色:各孔加入顯色劑A液50ul后,再加入顯色劑B液50ul。
11、終止:25-37℃下避光反應(yīng)10-15分鐘,加入50ul終止液。
12、讀板:在450nm波長讀取各孔的OD值。
應(yīng)用[4][5]
用于二烯丙基三硫?qū)χ嗵钦T導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺表面活性蛋白SP-A、SP-B mRNA表達(dá)的影響研究
選用LPS作為致傷劑復(fù)制小鼠ALI動(dòng)物模型,從肺組織病理變化、肺濕/干重比以及SP-A、SP-B mRNA表達(dá)觀察了DATS對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI小鼠的預(yù)防作用,以期進(jìn)一步為臨床預(yù)防ALI/ARDS提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇健康昆明小鼠共130只。
隨機(jī)分為5組:（1）ALI組,每天腹腔注射與DATS等體積生理鹽水一次,連續(xù)注射7天后,腹腔注射LPS 10mg/kg;
（2）DATS預(yù)防組,每天腹腔注射（2mg/ml）DATS 30mg/kg一次,連續(xù)注射7天后,腹腔注射LPS 10mg/kg;
（3）DATS治療組,每天腹腔注射與DATS等體積生理鹽水一次,連續(xù)注射7天后,腹腔注射LPS10mg/kg,之后30min再腹腔注射（2mg/ml）DATS 30mg/kg一次;
（4）DATS組,每天腹腔注射（2mg/ml）DATS 30mg/kg一次,連續(xù)注射7天;
（5）生理鹽水對(duì)照組,每天腹腔注射與DATS等體積生理鹽水一次,連續(xù)注射7天。各組動(dòng)物（n=6）均按2h、6h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)脫頸處死,測定各組肺組織濕/干重比值（wet/dry weight raito,W/D）,評(píng)估肺水腫程度。
用反轉(zhuǎn)錄PCR（reveuse transcription PCR,RT-PCR）檢測各組肺組織SP-A、SP-B mRNA表達(dá),并用Gel-pro凝膠分析軟件對(duì)RT-PCR產(chǎn)物半定量分析。用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示,多組均數(shù)比較行單因素方差分析（ANOVA）,兩兩比較用最小顯著差法（least significant difference,LSD）;各兩組均數(shù)比較行兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（independent samples t Test）,P<0.05為有顯著性差異。各組動(dòng)物（n=2）注射LPS后12h,用HE染色（hematoxylin and eosin stain,HE stain）光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。
結(jié)果:1肺W/D變化ALI組,2h時(shí)肺W/D較對(duì)照組無明顯變化（P>0.05）,6h時(shí)肺W/D較對(duì)照組顯著升高（P<0.05）,表明出現(xiàn)肺水腫。6h時(shí),DATS預(yù)防組肺W/D與ALI組相比顯著下降（P<0.05）,但DATS治療組與ALI組相比肺W/D無明顯改善（P>0.05）。單獨(dú)注射DATS組與對(duì)照組無明顯差異（P>0.05）。
2肺組織形態(tài)學(xué)變化肺大體觀察,對(duì)照組及DATS組肺外觀均無明顯異常改變;ALI組肺體積增大,呈暗紅色,散在有大小不一的紅色斑點(diǎn),切面疏松,有淡紅色液體溢出;DATS預(yù)防組較ALI組病變明顯減輕,但DATS治療組較ALI組無明顯變化。光鏡觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變發(fā)現(xiàn),對(duì)照組及DATS組肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡間隔無水腫,肺泡腔清晰;ALI組肺泡間隔增寬,腔內(nèi)有少許出血、滲出及炎性細(xì)胞浸潤,肺間質(zhì)充血水腫,有大量炎性細(xì)胞浸潤;DATS預(yù)防組肺組織中炎細(xì)胞浸潤、滲出及出血等形態(tài)學(xué)變化較ALI組明顯減輕;DATS治療組無明顯改善。
3肺組織SP-A、SP-B mRNA表達(dá)注射LPS后2h、6h,ALI組肺組織SP-A mRNA表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（P<0.05）;DATS預(yù)防組與ALI組相比,肺組織中SP-A mRNA表達(dá)均升高（P<0.05）,但仍低于對(duì)照組（P<0.05）;DATS治療組肺組織SP-A、SP-B mRNA表達(dá)與ALI組相比均無明顯差異（P>0.05）;DATS組肺組織SP-A、SP-B mRNA表達(dá)和相應(yīng)的對(duì)照組相比較均無明顯變化（P>0.05）。同組肺組織內(nèi)SP-A、SP-B各自2h、6h mRNA表達(dá)相比較均無明顯變化（P>0.05）。
參考文獻(xiàn)
[1]Reactive Oxygen Species Inactivation of Surfactant Involves Structural and Functional Alterations to Surfactant Proteins SP-B and SP-C[J].Karina Rodríguez-Capote,Dahis Manzanares,Thomas Haines,Fred Possmayer.Biophysical Journal.2006(8)
[2]An aqueous extract of Platycodi radix inhibits LPS-induced NF-κB nucleartranslocation in human cultured airway epithelial cells[J].Jun-Hyuk Lee,Yung-Hyun Choi,Ho-Sung Kang,Byung-Tae Choi.International Journal of Molecular Medicine.2004(6)
[3]High-performance ion-pair chromatography method for simultaneous analysis of alliin,deoxyalliin,allicin and dipeptide precursors in garlic products using multiple mass spectrometry and UV detection[J].I Arnault,J.P Christidès,N Mandon,T Haffner,R Kahane,J Auger.Journal of Chromatography A.2003(1)
[4]Ventilator-induced heat shock protein 70 and cytokine mRNA expression in a model of lipopolysaccharide-induced lung inflammation[J].Harrit A.Vreugdenhil,Jack J.Haitsma,Koos J.Jansen,Jitske Zijlstra,Frans B.Pltz,Jaap E.van Dijk,Burkhard Lachmann,Hans van Vught,Cobi J.Heijnen.Intensive Care Medicine.2003(6)
[5]郭園園.二烯丙基三硫?qū)χ嗵钦T導(dǎo)急性肺損傷小鼠肺表面活性蛋白SP-A、SP-B mRNA表達(dá)的影響[D].河北醫(yī)科大學(xué),2008.