背景[1-3]
植物DNA試劑盒適適用于從植物組織和植物干粉中提取總DNA，包括基因組DNA，線粒體DNA以及葉綠體DNA。本品可以處理多至100 mg的樣本，可純化獲得為50 kb的DNA，多數(shù)片段在20-30 kb之間。本試劑盒采用先進(jìn)的硅膠膜技術(shù)和簡(jiǎn)單的離心程序，無(wú)需乙醇沉淀，簡(jiǎn)單快速地分離得到高純度的DNA，有效去除PCR和其他酶促反應(yīng)的抑制劑。本品可以在1小時(shí)內(nèi)完成總DNA的提取，純化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文庫(kù)構(gòu)建、Southern Blot、分子標(biāo)記等下游實(shí)驗(yàn)。
植物DNA試劑盒
操作步驟：
1、取植物新鮮組織約100 mg或干重組織約20 mg，加入液氮充分研磨。
2、將研磨后的粉末收集到離心管(自備)中，加入700μl 65℃預(yù)熱的Buffer GP1(使用前在預(yù)熱的Buffer GP1中加入β-巰基乙醇，使其終濃度為0.1%)，迅速顛倒混勻后，將離心管置于65℃水浴20分鐘，水浴過(guò)程中顛倒離心管混勻樣品數(shù)次。
3、加入700μl氯仿，充分混勻，12000rpm(～～13400×g)離心5分鐘。
4、小心將上層水相轉(zhuǎn)入一新的離心管(自備)中，加入700μl Buffer GP2，充分混勻。
5、將步驟4中所得溶液全部加入到已裝入收集管的吸附柱DM中。若一次不能加完溶液，可分多次轉(zhuǎn)入。12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
6、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
注意：如需進(jìn)一步提高DNA純度，可重復(fù)步驟7.
8、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘，以徹底晾干。
9、將吸附柱置于一個(gè)新的離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-100μlBuffer GE或滅菌水，室溫放置2-5分鐘，12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。
應(yīng)用[4][5]
用于柿屬植物DNA提取純化檢測(cè)技術(shù)體系的建立研究
柿屬（Diospyros spp．）植物為多年生木本植物，其葉片和其他組織中富含大量的多糖、多酚等代謝產(chǎn)物，使提取高質(zhì)量的DNA比較困難。本課題以柿屬植物為材料，對(duì)芽、嫩葉、成熟葉、老葉、組培苗、花、萼片、一年生韌皮部、果實(shí)及其加工產(chǎn)品柿餅等不同來(lái)源的組織器官進(jìn)行基因組DNA提取，試圖建立和完善一套不受時(shí)間以及取材部位限制的高質(zhì)量DNA提取純化檢測(cè)技術(shù)體系。該技術(shù)的建立和優(yōu)化將為植物種質(zhì)保存、鑒定和評(píng)價(jià)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也將為植物品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)、基因文庫(kù)構(gòu)建、分子輔助育種和基因克隆重組、功能鑒定等的分子生物學(xué)下游實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)支持。
主要的研究結(jié)果如下：1．用堿裂解法、氯化芐提取法、高鹽低pH法、改良SDS法、改良CTAB法及試劑盒法等六種方法對(duì)前川次郎組培苗、芽、一年生韌皮部、嫩、葉、花、萼片、幼果、成熟葉、成熟果、老葉、柿餅等不同組織器官進(jìn)行DNA提取，堿裂解法操作簡(jiǎn)易省時(shí)，但提取效果不佳，其結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性較差。另外幾種DNA提取方法都在原有方法上作了一定的簡(jiǎn)化，提取到的DNA質(zhì)量尚佳，OD260／OD280在1.66-1.78之間，能夠用作PCR擴(kuò)增，說(shuō)明簡(jiǎn)化操作流程對(duì)DNA質(zhì)量要求不是太高的PCR反應(yīng)是可行的。
2．基于CTAB法對(duì)鄂柿一號(hào)、前川次郎、君遷子等3份材料進(jìn)行了DNA提取純化，結(jié)果表明：（1）不同時(shí)期采樣對(duì)DNA產(chǎn)率影響很大，隨葉片生長(zhǎng)，DNA產(chǎn)率不斷下降，成熟葉片DNA產(chǎn)率僅為幼嫩葉片的16.7-19.4％；（2）在苯酚氯仿法、高鹽乙醚法、CTAB沉淀法等三種純化方法中以高鹽乙醚法效果，可酶切，能有效去除多糖污染，產(chǎn)率較高；（3）四種沉淀方法中，高濃度的鹽溶液有助于去除多糖、多酚等雜質(zhì)，相比單純的乙醇或異丙醇沉淀獲得更高質(zhì)量的DNA。
參考文獻(xiàn)
[1]An efficient protocol for genomic DNA extraction fromCitrus species[J].Yun-Jiang Cheng,Wen-Wu Guo,Hua-Lin Yi,Xiao-Min Pang,Xiuxin Deng.Plant Molecular Biology Reporter.2003(2)
[2]DNA extraction from plants:The use of pectinase[J].Steven Rogstad,Brian Keane,Carolyn Keiffer,Fred Hebard,Paul Sisco.Plant Molecular Biology Reporter.2001(4)
[3]A Rapid DNA Minipreparation Method Suitable for AFLP and Other PCR Applications[J].D.-H.Chen,P.C.Ronald.Plant Molecular Biology Reporter.1999(1)
[4]Comparative Analysis of Different DNA Extraction Protocols:A Fast,Universal Maxi-Preparation of High Quality Plant DNA for Genetic Evaluation and Phylogenetic Studies[J].U.M.Csaikl,H.Bastian,R.Brettschneider,S.Gauch,A.Meir,M.Schauerte,F.Scholz,C.Sperisen,B.Vornam,B.Ziegenhagen.Plant Molecular Biology Reporter.1998(1)
[5]易慶平.柿屬植物DNA提取純化檢測(cè)技術(shù)體系的建立[D].華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.