給大家介紹一篇今年發(fā)表在Carbohydrate Polymers上的文章。在這篇文章中，作者進(jìn)行分子動力學(xué)模擬研究 CMCS（羧甲基殼聚糖） 在水中的聚集行為，以及脫乙酰度(DD) 、取代度 (DS) 和電離狀態(tài)（不同的 pH 條件）的影響。CMCS在中性條件下更容易聚集，分子鏈交錯堆疊自組裝成多聚體，而在酸性和堿性條件下分別通過扭曲堆疊和平行堆疊形成二聚體或三聚體。隨著DD和DS的增加，在中性和堿性條件下聚集變?nèi)?，而在酸性環(huán)境中聚集變強(qiáng)。分子內(nèi)氫鍵的存在在酸性、堿性和中性條件下分別導(dǎo)致單個鏈的扭曲、共面和延伸構(gòu)象，從而導(dǎo)致它們獨(dú)特的鏈間堆疊結(jié)構(gòu)。隨后，特定的分子間氫鍵、疏水和靜電相互作用穩(wěn)定了聚集結(jié)構(gòu)。

CMCS鏈通常由β- (1→4)-連接的D-氨基葡萄糖主鏈和C6-OH位置上的取代羧甲基側(cè)鏈以及C2-NH2位置上殘留的乙酰氨基組成(圖1a）。這項工作中CMCS的主鏈構(gòu)象由糖苷鍵的兩個二面角（φ和ψ）表示，指的是每個鍵處圍繞兩個醚鍵的旋轉(zhuǎn)（圖1b）。為了闡明DD和 DS 在構(gòu)象動力學(xué)和聚集行為中的作用，作者設(shè)計了含有不同DD和DS組合的CMCS 分子（圖 1c)。所有的CMCS都包含五個片段，乙酰氨基和羧甲基基團(tuán)分布均勻。

為了了解兩性結(jié)構(gòu)的質(zhì)子化狀態(tài)如何影響 CMCS 分子的聚集，作者研究了三種 pH 條件下 CMCS 的三種質(zhì)子化狀態(tài)（完全帶正電荷、帶負(fù)電荷和雙電荷）。根據(jù)實驗結(jié)果，羧基的 pKa 值在2.0和4.0之間，氨基的大約在6.5至6.8之間。在這項工作中模擬了強(qiáng)酸性（pH ~ 1-2）和強(qiáng)堿性（pH~10-14）環(huán)境，以分別說明CMCS完全帶正電和帶負(fù)電狀態(tài)的影響。此外，氨基在中性條件下（pH ~ 7）被部分質(zhì)子化，用于研究CMCS的雙電荷狀態(tài)。

圖1

聚集動力學(xué)

作者研究比較了 DD、DS 和電離狀態(tài)對聚集行為的影響。團(tuán)簇數(shù)和相應(yīng)的團(tuán)簇大小分布（每個簇的 CMCS 分子數(shù)）如圖2所示。在中性條件下，所有的CMCS都可以聚集成團(tuán)簇簇，簇數(shù)最?。▓D3a）；相應(yīng)地，更多的 CMCS 分子被整合到一個團(tuán)簇中（圖3b）。在這種情況下，電離的 CMCS 具有較低的電荷（見圖 1c 中的凈電荷），導(dǎo)致分子間能量勢壘減少，同時質(zhì)子化氨基（-NH3+）和去質(zhì)子化羧基（-COO-）之間形成額外的靜電吸引力，可以促進(jìn)聚集。同時，作為離子化氫鍵供體或受體的雙電荷結(jié)構(gòu)（-NH3+和-COO-）與非離子化對應(yīng)物形成的氫鍵相比，有利于形成更強(qiáng)的電荷輔助氫鍵。額外的靜電吸引力和氫鍵相互作用的結(jié)合是中性條件下形成強(qiáng)而穩(wěn)定的聚集的原因。另一方面，在酸性和堿性條件下，單電荷CMCS結(jié)構(gòu)導(dǎo)致更強(qiáng)的靜電排斥，而膠體大分子之間的氫鍵相互作用更弱。弱的吸引能量不能將更多的CMCS鏈合并到簇中，也無法克服靜電排斥的能量障礙來穩(wěn)定聚集體，導(dǎo)致聚集受限和波動。

圖2 

此外，DD和DS在聚集過程中也起著至關(guān)重要的作用。對于中性和堿性條件下的低羧甲基化系統(tǒng)（CM1CS1、CM1CS2 和 CM1CS3），它們的團(tuán)簇數(shù)略有增加，并且團(tuán)簇大小隨著DD的增加而降低，即聚集能力減弱。對于具有相同 DD 的系統(tǒng)（CM1CS2、CM2CS2、CM3CS2 和 CM4CS2），隨著 DS 的增加，聚集進(jìn)一步顯著減少。相比之下，DD和DS在酸性條件下對CMCS的聚集表現(xiàn)出相反的作用，即隨著DD和DS的增加，聚集趨勢變得更加明顯。團(tuán)簇大小相應(yīng)增加，顯示出更少的單聚體，而出現(xiàn)更多的二聚體。與在中性和堿性條件下增加–COO- 基團(tuán)阻止 CMCS 聚集不同，酸性形式的羧基 (-COOH) 促進(jìn)了聚集，因為鏈之間的靜電排斥減弱以及 -COOH 基團(tuán)之間形成分子間氫鍵的可能性增加。

聚集機(jī)理

除了靜電作用，作者對各種CMCS系統(tǒng)進(jìn)行了關(guān)于氫鍵的進(jìn)一步機(jī)理分析。圖3a描繪了CMCS分子之間形成的氫鍵的總數(shù)。由于雙電荷結(jié)構(gòu)，在中性pH值下形成更多的氫鍵，然后是堿性和酸性條件下。在三種pH條件下形成的氫鍵數(shù)量與各自酸堿環(huán)境中的聚集能力一致，證實了氫鍵相互作用是聚集的主要吸引力。然而，酸性條件下的氫鍵總數(shù)隨著DD和DS的增加而增加，而在中性和堿性條件下則略有下降趨勢。因此，酸性條件下增強(qiáng)的聚集可歸因于增強(qiáng)的氫鍵相互作用。此外，作者比較了由羧基的主要基團(tuán)（-COO -/COOH)、乙酰氨基 (-NHC=O) 和主鏈上的醚氧原子 (O-main)形成氫鍵的情況，結(jié)果如圖3b所示。-COO -/COOH基團(tuán)的氫鍵從特定氫鍵供體接受，如圖3c所示，對于中性和堿性條件，氫鍵主要在–COO-和–OH 之間形成。在酸性條件下，形成的氫鍵表現(xiàn)出對DS的依賴性。對于低羧甲基化體系（CM1CS1、CM1CS2 和 CM1CS3），–COOH 和 –NH3+之間形成的氫鍵數(shù)量增加隨著 DD 的增加，對總氫鍵的增加有顯著貢獻(xiàn)。雖然從-NHC=O基團(tuán)接受的-COOH的氫鍵數(shù)量隨著DD的增加而減少（完全脫乙?；腃M1CS3減少到0），但由于-NHC=O的數(shù)量較少，它并沒有顯著改變趨勢團(tuán)體。另一方面，對于高羧甲基化體系（CM2CS2、CM3CS2 和 CM4CS2），–COOH 基團(tuán)更傾向于與其自身形成氫鍵，導(dǎo)致由–COOH 形成的氫鍵數(shù)量減少；然而，總氫鍵數(shù)量的增加被 -NHC=O 和醚氧原子中氫鍵數(shù)量的增加所補(bǔ)償。值得注意的是，側(cè)鏈上的-COOH基團(tuán)之間的氫鍵主要是分子間的，因為它們在鏈外交替分布，這支持了在酸性條件下隨著DS的增加而促進(jìn)聚集的結(jié)果。

圖3

聚集結(jié)構(gòu)

CM2CS2分子可以在三種pH條件下自組裝成三種不同的結(jié)構(gòu)，如圖4a所示。在酸性、中性和堿性條件下，作者將它們分別分類為扭曲堆疊、交錯堆疊和平行堆疊。其他 CMCS 在各自的 pH 條件下顯示相同的堆積模型，CMCS在不同pH條件下的帶電狀態(tài)對其聚集結(jié)構(gòu)有很大影響，而DD和DS的變化主要影響它們的聚集團(tuán)簇大小。對于中性條件下的交錯聚集結(jié)構(gòu)，在團(tuán)簇內(nèi)形成了密集的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。此外，在聚集結(jié)構(gòu)的中間可以觀察到頭對尾的連接。其中最小和電位分布在分子鏈的兩端，兩性聚合物之間的靜電相互作用有助于它們通過交錯堆疊聚集（圖4 c）。根據(jù)在中性溶液中的實驗測量中觀察到的微凝膠形態(tài)，這種交錯堆疊可以演變成網(wǎng)狀凝膠狀結(jié)構(gòu)。

    對于酸性條件下的扭曲堆積，觀察到-COOH之間的分子間氫鍵可以穩(wěn)定聚集結(jié)構(gòu)。這種扭曲的堆疊可以演變成球形納米結(jié)構(gòu)，類似于酸性條件下的殼聚糖聚集體（Philippova et al., 2012）。然而，對于堿性條件下的平行堆疊，-COO-之間的大部分H 鍵和-OH基團(tuán)是分子內(nèi)的，不能穩(wěn)定堆疊結(jié)構(gòu)。在酸性和堿性條件下形成的分子內(nèi)或分子間氫鍵的直接觀察證實了氫鍵分析。因此，堿性條件下單電荷CMCS之間缺乏分子間氫鍵和靜電排斥表明它們的聚集體應(yīng)該有其他穩(wěn)定作用。通常，聚集過程由聚合物-聚合物和聚合物-水相互作用決定。為了評估這種競爭，作者在簇中每個分子鏈的 3 ? 范圍內(nèi)呈現(xiàn)溶劑化層和平均溶劑可及表面積 (SASA)。如圖6 b所示，水分子通常被排除在核心之外，即形成疏水域。考慮到 CMCS 的化學(xué)結(jié)構(gòu)，疏水性吡喃糖環(huán)主要負(fù)責(zé)疏水性相互作用。這種效果在堿性條件下很明顯，其中吡喃糖環(huán)平行堆疊形成疏水核，而親水側(cè)鏈浸入溶劑中。因此，可以得出結(jié)論，吡喃糖環(huán)的疏水相互作用在這種聚集過程中起重要作用，這在其他多糖中也觀察到（Uto et al., 2020）。這種以平行方式排列的鏈傾向于演變成納米纖維. 此外，由分子間氫鍵形成的聚集體的連接區(qū)也可以被檢測為疏水域并從溶劑中篩選出來 ( Philippova et al., 2012 )，這解釋了在中性和酸性條件下排除水的原因。因此，CMCS在不同電離狀態(tài)下的鏈間相互作用伴隨著SASA的降低。正如預(yù)期的那樣，可以發(fā)現(xiàn) SASA 和團(tuán)簇數(shù)之間的良好相關(guān)性，如圖 6 d 所示。具體來說，SASA 值越低，聚集程度越強(qiáng)。同時，CMCS 的相互作用擴(kuò)大了 SASA 差異，也表明聚集行為取決于 CMCS 的結(jié)構(gòu)參數(shù)（DD 和 DS）和電離狀態(tài)，如前所述。

圖4

構(gòu)象動力學(xué)

圖 5 a-c給出了 CM2CS2 系統(tǒng)的每個連接的 FEL（自由能圖）以及在三種pH條件下不同電離狀態(tài)下相應(yīng)的優(yōu)選構(gòu)象，圖5d顯示了糖苷鍵從非還原端到還原端的序列號和分布。優(yōu)選的構(gòu)象是從所有鏈接都處于全局最小能量（深藍(lán)色）的共同軌跡中提取的，因此代表數(shù)量最多的（φ，ψ）分布和最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。FEL圖中的白色區(qū)域是本工作中自由能高于20 kJ·mol-1的不利或不可獲得的結(jié)構(gòu)，其他淺能盆地代表MD模擬期間的亞穩(wěn)態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)象。

圖5

對于酸性條件下的CM2CS2（圖5a），所有四個連接處的φ二面角在-60°左右的FEL上采用全局最小值，而ψ二面角可以在-180°到+180°的整個范圍內(nèi)變化. 這種行為表明糖苷鍵向非還原端的旋轉(zhuǎn)非常受限，而向還原端的旋轉(zhuǎn)則非常動態(tài)。這是由于糖苷鍵周圍的軌道-軌道相互作用(exo-anomeric效應(yīng))，顯示出對非還原端糖苷鍵的穩(wěn)定作用（Skovstrup等人，2010）。較大的 ψ 波動決定了整條鏈的高構(gòu)象自由度，造成單條鏈的扭曲和多條鏈的扭曲堆疊。似乎單個鏈?zhǔn)亲罱K自組裝結(jié)構(gòu)的構(gòu)建塊。此外，可以在單個鏈中找到–COOH 和–NHC=O之間的分子內(nèi)氫鍵。然而，不足以穩(wěn)定整個分子鏈，并且由兩個側(cè)鏈上的基團(tuán)形成的這種氫鍵不能限制主鏈的旋轉(zhuǎn)。因此，酸性條件下的分子鏈?zhǔn)侨犴g的。當(dāng)與其他鏈相互作用時，-COOH基團(tuán)之間的分子間氫鍵占主導(dǎo)地位，以穩(wěn)定密集的聚集體。圖5 b 顯示了 CM2CS2 在中性條件下的 FEL。類似地，幾乎不變的 φ 二面角以及可變的 ψ 二面角表明存在鏈上穩(wěn)定的exo-anomeric效應(yīng)。然而，φ二面角在-120°附近有較高值，表明CMCS在中性條件下的鏈結(jié)構(gòu)更加拉伸。對于堿性條件下的 CM2CS2（圖5c），exo-anomeric效應(yīng)也導(dǎo)致了 -120° 附近的受限 φ 二面角。

在這項工作中，進(jìn)行了一系列 MD 模擬以研究 CMCS 分子在水溶液中的動態(tài)聚集行為。模擬結(jié)果表明，不同的CMCS可以自組裝成不同的聚集結(jié)構(gòu)。中性條件下采用交錯堆積，聚集作用更強(qiáng)、更穩(wěn)定，堿性條件下平行堆積，酸性條件下通過扭曲堆疊。此外，結(jié)構(gòu)差異決定了聚集程度：較高的DD和DS導(dǎo)致中性和堿性條件下的聚集較弱；同時在酸性條件下導(dǎo)致更強(qiáng)的聚集。隨著 DD 和 DS 的增加，在中性和堿性條件下，較低的靜電勢和氫鍵對減少聚集起主導(dǎo)作用。然而，在酸性條件下，隨著DD和DS的增加，聚集的增加主要由分別在-COOH 和 -NH3+基團(tuán)之間以及-COOH 基團(tuán)之間形成的分子間氫鍵控制。作者還通過 SASA 計算考慮了疏水相互作用，這是堿性條件下的主要穩(wěn)定作用。此外，分子內(nèi)氫鍵和exo-anomeric效應(yīng)可以穩(wěn)定單個鏈，這對于它們作為構(gòu)建單元的組裝結(jié)構(gòu)起著重要作用。

參考文獻(xiàn)：

Carbohydrate Polymer 2022, 297, 119993

https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2022.119993.