背景[1-3]
磷酸化蛋白富集試劑盒是利用磷酸基團(tuán)與金屬的親和力,采用固定化金屬螯合層析(IMAC)的方法富集磷酸化蛋白?？梢赃x擇性的對(duì)磷酸化蛋白和多肽進(jìn)行富集和純化。本試劑盒可以用來(lái)提取富集哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織、細(xì)菌、酵母、植物等樣本的的磷酸化蛋白。經(jīng)本試劑盒制備的蛋白樣品可用于Western blotting,mass spectrometry,2D-PAGE和protein arrays等下游應(yīng)用。
磷酸化是蛋白質(zhì)中最常發(fā)生的翻譯后修飾之一，可調(diào)節(jié)幾乎所有的細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)事件，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白-蛋白相互作用、蛋白穩(wěn)定性、蛋白定位、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期控制。鑒于磷酸基的短暫不穩(wěn)定狀態(tài)，檢測(cè)蛋白磷酸化的變化可能是一項(xiàng)較困難的任務(wù)。此外，低磷蛋白豐度和開發(fā)效果不佳的磷酸化特異性抗體也使得磷蛋白檢測(cè)存在困難。質(zhì)譜(MS)技術(shù)的最新進(jìn)展結(jié)合使用固定化金屬親和色譜(IMAC)進(jìn)行的磷蛋白富集，提高了磷酸化蛋白質(zhì)組的分離度。
磷酸化蛋白富集試劑盒
蛋白樣品的準(zhǔn)備：
以下為由新鮮植物細(xì)胞和組織制備蛋白樣品的參考步驟，其它方法得到的蛋白樣品稀釋至蛋白濃度為0.25-0.5mg/ml后直接上樣即可，確保蛋白樣品的pH值低于6。
可以用試劑盒中的洗柱液、裂解液、洗滌液稀釋蛋白樣品。
植物細(xì)胞裂解：
1．提取液制備：每500μl冷的裂解液中加入2μl蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。
2．取植物細(xì)胞樣本，在4℃，1000Xg條件下離心5-10分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。
3．用冷生理鹽水洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。
4．每50-100mg細(xì)胞樣本中加入500μl冷的蛋白裂解液，混勻后勻漿處理，然后在4℃條件下振蕩15分鐘。
5.在4℃，14000Xg條件下離心15分鐘。
6．快速將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白裂解液。
植物組織蛋白提?。?/p>
1．裂解液制備：每500μl冷的提取液中加入2μl蛋白酶磷酸酶抑制劑，混勻后置冰上備用。
2．取200mg植物組織樣本，去除粗筋脈絡(luò)等后盡可能剪碎，置于研缽中用液氮研磨。(沒有液氮條件也可直接置冰上加入裂解液研磨即可)
3．研磨后加入500μl提取液，混勻后于一個(gè)預(yù)冷的干凈離心管中在4℃條件下振蕩2-3小時(shí)。
4．在4℃，14000Xg條件下離心15分鐘。
5．將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。
二、柱平衡：
加入500μl洗柱液洗柱，重力作用下自然流下或4℃下500g力離心1分鐘甩干吸附柱。
三、上樣：
將以上蛋白裂解液或其它待富集蛋白樣品加入吸附柱，重力作用下自然流下或4℃下500g力離心1分鐘甩干吸附柱。
四、洗柱：
加入300μl洗滌液洗柱，重力作用下自然流下或4℃下500g力離心1分鐘甩干吸附柱。重復(fù)兩次。
五、洗脫：
加入500μl磷酸化蛋白洗脫液，重力作用下自然流下或4℃下1000g力離心1分鐘甩干吸附柱，收集洗脫液，即得到磷酸化蛋白。
應(yīng)用[4][5]
用于家貓感染弓形蟲后小腸蛋白的乙?；傲姿峄鞍捉M學(xué)分析研究
對(duì)排弓形蟲卵囊期間貓小腸的蛋白乙酰化組及磷酸化組進(jìn)行研究,探討弓形蟲卵囊發(fā)育過(guò)程對(duì)貓小腸蛋白質(zhì)修飾狀態(tài)的影響。
方法:本研究利用非標(biāo)記定量乙?；鞍捉M學(xué)技術(shù),來(lái)研究弓形蟲卵囊形成階段貓小腸蛋白的乙酰化狀態(tài)改變;基于同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（i TRAQ）磷酸化修飾蛋白組學(xué)技術(shù),來(lái)研究弓形蟲卵囊形成階段貓小腸蛋白的磷酸化狀態(tài)改變。
結(jié)果:研究結(jié)果表明,在弓形蟲卵囊形成階段貓小腸蛋白的乙酰化狀態(tài)發(fā)生顯著改變,共鑒定到2543條乙?；亩我约?357個(gè)乙酰化蛋白的2606個(gè)乙?；稽c(diǎn)。在感染弓形蟲的貓小腸中有334條肽段的乙?；l(fā)生下調(diào),82條肽段乙酰化發(fā)生上調(diào)。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),發(fā)生差異的乙酰化蛋白質(zhì)主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、線粒體和細(xì)胞外成分。
功能富集分析發(fā)現(xiàn),這些發(fā)生差異的乙?；鞍赘患谔墙徒?糖異生、檸檬酸鹽循環(huán)和過(guò)氧化物酶體。=還鑒定到了一批新的弓形蟲乙?；鞍?其中包括一種僅在卵囊或貓小腸上皮細(xì)胞表達(dá)的弓形蟲乙?；鞍?。在貓小腸蛋白的磷酸化修飾研究中,=共鑒定到4998條磷酸化肽段、1805個(gè)磷酸化蛋白及3497個(gè)磷酸化位點(diǎn)。
本研究中有82個(gè)蛋白的磷酸化狀態(tài)被下調(diào),1289個(gè)蛋白的磷酸化狀態(tài)被上調(diào)。對(duì)差異磷酸化蛋白進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn),差異磷酸化蛋白主要參與了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組、壞死以及免疫反應(yīng)。
結(jié)論:本研究結(jié)果表明,弓形蟲感染對(duì)貓小腸蛋白修飾狀態(tài)具有廣泛的影響。通過(guò)本研究,初步了解了弓形蟲感染如何影響終末宿主小腸蛋白的乙?；c磷酸化修飾狀態(tài)。
參考文獻(xiàn)
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[3]Toxoplasma gondii:An Underestimated Threat?[J].Milne Gregory,Webster Joanne P.,Walker Martin.Trends in Parasitology.2020(prep)
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