TCEP鹽酸鹽，即三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽是一種有效的、通用的、無臭的且不含硫醇的還原劑，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和其他涉及二硫鍵還原的研究。該產(chǎn)品在很多溶劑中有較好的溶解度和穩(wěn)定性，還原二硫鍵的效果與DTT相似，但是又不像DTT或其他含硫還原劑必須在巰基交聯(lián)反應(yīng)前去除。

TCEP還原有機(jī)二硫鍵

三烷基膦化合物還原蛋白質(zhì)二硫鍵的能力和優(yōu)點(diǎn)早已為人們所熟知，但由于在水中溶解度差以及難聞的氣味導(dǎo)致應(yīng)用較少。磷酸鹽在水溶液中較穩(wěn)定，可以選擇性斷裂二硫鍵，并且對其他官能團(tuán)幾乎沒有作用，三（2-羧乙基）膦（TCEP）的發(fā)現(xiàn)克服了三烷基膦化合物的缺點(diǎn)從而被廣泛應(yīng)用。

TCEP在較寬的pH范圍可以選擇性地、徹底地還原在水中穩(wěn)定的烷基二硫化合物，室溫條件下還原甚至不到5分鐘。TCEP沒有揮發(fā)性、無刺激性氣味，也不像其他大部分還原劑在空氣中易被氧化。與DTT相比，TCEP更穩(wěn)定、活性更強(qiáng)，并且可以在低pH值時(shí)還原二硫鍵。

1. 溶解度

三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽（分子量：286.65）在水中有很好的溶解度，可達(dá)到310g/L（1.08M）。作為親水性化合物，在水緩沖液中TCEP幾乎在任何pH下都有非常好的溶解性，因此在大部分水緩沖液中的反應(yīng)濃度和10X的存儲(chǔ)液很容易制備。TCEP在有機(jī)溶劑中有較小溶解度的只有甲醇和乙醇。

2. 在溶液中穩(wěn)定性

TCEP在水、酸和普通溶液中非常穩(wěn)定，溶于水中的pH約為2.5。研究指出，室溫下TCEP在100mM HCl或100mM NaOH溶液中放置24小時(shí)無變化，同樣在如下50mM緩沖液中也無變化：Tris?HCl（pH 7.5, 8.5和9.5）、HEPES（pH6.8和8.2）、硼酸鹽緩沖液（pH8.2和10.2）和CAPS（pH9.7和11.1），甚至TCEP在這些緩沖液中三周，被氧化部分也少于20%。

TCEP在磷酸鹽緩沖液中并不是特別穩(wěn)定，尤其是在中性pH條件下。實(shí)驗(yàn)指出在pH值為7.0的0.35M磷酸鹽緩沖鹽（PBS）中72小時(shí)內(nèi)被完全氧化，與在pH值為8.0的0.15M PBS中約50%被氧化的時(shí)間相同。只有在pH>10.5或<6.0的PBS中，TCEP才只發(fā)生輕微氧化。因此，如果在PBS緩沖液中使用TCEP，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3. 還原活性的pH范圍

TCEP可以在較寬的pH范圍有效的還原二硫鍵，實(shí)驗(yàn)表明TCEP在1.5<pH<9.0之間，30秒內(nèi)即可完全還原2,2′二硫代二吡啶（2,2′-DTDP），但在pH＞9時(shí)，只有50%的2,2′-DTDP被還原。在pH<8.0時(shí)，TCEP比DTT效果更好，甚至可以還原被氧化的DTT。

4. 反應(yīng)濃度

對于大多數(shù)反應(yīng)，室溫下5-50mM TCEP可以提供足夠的摩爾濃度在幾分鐘內(nèi)有效還原肽或蛋白質(zhì)的二硫鍵。pH在1.5-8.5之間時(shí)，30μM的TCEP可以在40秒內(nèi)將2,2′-DTDP(20μM) 完全還原。當(dāng)使用等摩爾量的TCEP時(shí)反應(yīng)時(shí)間將延長很多，Mery報(bào)告顯示TCEP與二硫化合物摩爾比1:1時(shí)，反應(yīng)時(shí)間將近一小時(shí)。

5. 使用兼容性

因?yàn)門CEP不含硫醇，因此不需要在馬來酰亞胺標(biāo)記或交聯(lián)反應(yīng)前去除。大多數(shù)情況下，TCEP濃度小于10-20mM時(shí)，與馬來酰亞胺的化學(xué)反應(yīng)也是可以兼容的。

TCEP（50mM）可以替代DTT或2-巰基乙醇作為SDSPAGE的還原樣品緩沖液，然而因?yàn)門CEP在溶液中帶電荷，所以不適合二維等電聚焦電泳（IEF）。