背景[1-3]
NCI-H226人肺鱗癌貼壁細胞系來源于男性肺鱗癌（胸膜間皮瘤）患者胸腔積液轉(zhuǎn)移病灶。NCI-H226細胞可以用于3D細胞培養(yǎng)、癌癥研究、高通量篩選、毒理學(xué)研究。
NCI-H226人肺鱗癌貼壁細胞系
NCI-H226人肺鱗癌貼壁細胞系細胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程參考：
1、NCI-H226人肺鱗癌貼壁細胞系細胞復(fù)蘇
1）配制完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）細胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺中，化凍的細胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到細胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察細胞貼壁情況（未貼壁的即為死細胞--針對貼壁細胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、NCI-H226人肺鱗癌貼壁細胞系細胞傳代
1）待細胞生長到80%-90%匯合度時，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無菌PBS潤洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細胞消化時間不同），取出細胞，鏡下觀察細胞至細胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使細胞脫落下來成單個細胞懸液，收集細胞于15ml無菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集細胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細胞生長速度調(diào)整比例），分別加入到2個新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、NCI-H226人肺鱗癌貼壁細胞系細胞凍存
1）按照細胞傳代方法，在超凈工作臺內(nèi)消化收集細胞沉淀，取少量細胞用于計數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無血清細胞凍存液重懸細胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過夜后，轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
應(yīng)用[4][5]
NCI-H226人肺鱗癌貼壁細胞系可以用于組蛋白乳酸化調(diào)控TRIM29影響肺鱗癌進展的機制研究
利用生物信息學(xué)、細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù),探討組蛋白乳酸化通過TRIM29調(diào)控肺鱗癌細胞生物學(xué)行為的機制。本研究為肺鱗癌分子靶向治療提供新的潛在靶點。
方法:1、生物信息學(xué)、臨床肺鱗癌石蠟包埋組織切片分析TRIM29在癌與癌旁正常組織中的表達,分析TRIM29與肺鱗癌患者的臨床特征及預(yù)后相關(guān)性。
2、RT-qRCR、Western blot及細胞免疫熒光驗證肺鱗癌細胞株中TRIM29的表達及靶向TRIM29的siRNA轉(zhuǎn)染效果。CCK8增殖實驗、細胞劃痕等實驗證實TRIM29表達量變化對肺鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響。
3、生物信息學(xué)分析LDHA在肺鱗癌的癌與癌旁正常組織中的表達;免疫組化分析肺鱗癌石蠟包埋組織中組蛋白乳酸化Pan Kla、H3K181a的細胞表達定位;RT-qPCR、Western blot及細胞免疫熒光驗證Pan Kla、H3K181a在肺鱗癌細胞株中的表達。
4、CCK8增殖實驗、細胞劃痕、小室遷移及侵襲實驗、克隆形成實驗等分析糖酵解抑制劑對肺鱗癌細胞生物學(xué)行為的影響;Western blot、RT-qPCR驗證糖酵解抑制劑干預(yù)后肺鱗癌細胞系中組蛋白乳酸化Pan Kla、H3K181a水平以及TRIM29表達的變化。
結(jié)果:1、通過下載及分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肺鱗癌基因表達和臨床病理信息,結(jié)果顯示,與相對應(yīng)的肺正常組織比較,TRIM29在肺鱗癌中高表達(P<0.05);TRIM29的表達與臨床特征以及患者的生存時間無相關(guān)性;免疫組化結(jié)果顯示,TRIM29定位在細胞質(zhì)。
2、與正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B相比,肺鱗癌細胞株NCI-H520及NCI-H226中的TRIM29表達量均更高;TRIM29 siRNA可以有效下調(diào)TRIM29蛋白的表達水平;下調(diào)TRIM29表達后肺鱗癌細胞增殖、遷移能力下降。
3、通過下載及分析TCGA數(shù)據(jù)庫中肺鱗癌基因表達和臨床病理信息,結(jié)果顯示,與相對應(yīng)的肺正常組織比較,LDHA在肺鱗癌中高表達;免疫組化顯示Pan Kla和H3K181a均定位在細胞核;與正常肺支氣管上皮細胞BEAS-2B相比,肺鱗癌細胞株NCI-H520及NCI-H226中的組蛋白乳酸化Pan Kla和H3K181a水平升高。
4、CCK8增殖實驗、細胞劃痕、小室遷移及侵襲實驗、克隆形成實驗等結(jié)果表明,糖酵解抑制劑可有效抑制肺鱗癌細胞增殖、遷移與克隆形成能力;且糖酵解抑制劑同時降低組蛋白乳酸化水平、TRIM29的mRNA及蛋白表達水平。
結(jié)論:1、TRIM29是肺鱗癌中重要的促癌基因,可作為診斷肺鱗癌疾病的重要生物標(biāo)志物。
2、組蛋白乳酸化水平降低可抑制肺鱗癌的進展。
3、組蛋白乳酸化調(diào)控TRIM29的表達影響肺鱗癌進展。
參考文獻
[1]Lactate,histone lactylation and cancer hallmarks..Dai Xiaofeng;Lv Xinyu.Expert reviews in molecular medicine,2023
[2]Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma..Yang Zijian;Yan Cong;Ma Jiaqiang;Peng Panpan;Ren Xuelian;Cai Shangli;Shen Xia;Wu Yingcheng;Zhang Shu;Wang Xiaoying;Qiu Shuangjian;Zhou Jian;Fan Jia;Huang He;Gao Qiang.Nature metabolism,2023
[3]Targeting lactate dehydrogenase B-dependent mitochondrial metabolism affects tumor initiating cells and inhibits tumorigenesis of non-small cell lung cancer by inducing mtDNA damage.Deng Haibin;Gao Yanyun;Trappetti Verdiana;Hertig Damian;Karatkevich Darya;Losmanova Tereza;Urzi Christian;Ge Huixiang;Geest Gerrit Adriaan;Bruggmann Remy;Djonov Valentin;Nuoffer Jean Marc;Vermathen Peter;Zamboni Nicola;Riether Carsten;Ochsenbein Adrian;Peng Ren Wang;Kocher Gregor Jan;Schmid Ralph Alexander;Dorn Patrick;Marti Thomas Michael.Cellular and Molecular Life Sciences,2022
[4]Identification of lysine-lactylated substrates in gastric cancer cells.Yang Dawei;Yin Jie;Shan Liuqun;Yi Xingling;Zhang Wei;Ding Yongbin.iScience,2022
[5]賴建飛.組蛋白乳酸化調(diào)控TRIM29影響肺鱗癌進展的機制研究[D].南昌大學(xué),2023.