背景^[1-3]

HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞是一種人結(jié)腸癌細(xì)胞系，通常用于研究人結(jié)腸癌的生物學(xué)特性和治療策略。這種細(xì)胞系是通過(guò)將人結(jié)腸癌的腫瘤組織進(jìn)行體外培養(yǎng)而獲得的。

HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞具有一些獨(dú)特的生物學(xué)特性，例如上皮細(xì)胞樣形態(tài)、貼壁生長(zhǎng)等。這種細(xì)胞系可以用于研究結(jié)腸癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，以及藥物篩選和化療藥物敏感性等方面的研究。

HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞

HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)操作

1)復(fù)蘇HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。

將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2)HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。

d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3)HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；

a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。

c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

應(yīng)用^[4-5]

HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞可以用于NDRG2調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制研究及其腸道特異性Ndrg2基因敲除小鼠的建立

Hepatocyte Growth Factor(HGF)是一個(gè)多功能的細(xì)胞生長(zhǎng)因子,通過(guò)結(jié)合c-MET調(diào)控下游PI3K/Akt、MEK/ERK、JAK/STAT等信號(hào)通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等生理過(guò)程,是組織器官發(fā)育的重要調(diào)控通路。c-MET的高表達(dá)或突變激活對(duì)于膠質(zhì)瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移都有重要的影響。HGF通過(guò)調(diào)控MEK/ERK和NF-κB等信號(hào)通路促進(jìn)肺泡Ⅱ型細(xì)胞、黑色素瘤和胃癌等腫瘤細(xì)胞系的增殖,但在某些腫瘤細(xì)胞系(Hep G2、Huh7、HT29、HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞等)中,HGF則發(fā)揮增殖抑制的功能。這種差異可能與HGF/c-MET信號(hào)通路與其他信號(hào)通路的交聯(lián)所導(dǎo)致的。轉(zhuǎn)基因小鼠模型為基因的在體功能研究提供了很好的研究策略。

NDRG2對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用已被多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)所證實(shí),通過(guò)Villi-Cre和Ndrg2-Loxp基因敲除系統(tǒng)構(gòu)建了Ndrg2的腸上皮細(xì)胞特異性敲除小鼠,初步分析Ndrg2對(duì)小鼠的小腸和結(jié)腸發(fā)育的影響,并從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中分析NDRG2可能參與結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的分子機(jī)制,為下一步研究打下基礎(chǔ)。蛋白的翻譯后修飾在蛋白功能發(fā)揮過(guò)程中發(fā)揮重要作用,特別是蛋白質(zhì)的賴(lài)氨酸乙?；揎棌V泛參與了蛋白質(zhì)的降解、轉(zhuǎn)位和分泌等諸多生理過(guò)程。初步分析了NDRG2的蛋白質(zhì)序列,結(jié)果顯示有三個(gè)比較保守的賴(lài)氨酸位點(diǎn)。

分別針對(duì)這三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行特異性組成型活化的突變(賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝滨０?和組成型失活的突變(賴(lài)氨酸突變?yōu)榫彼?,研究NDRG2蛋白序列中這三個(gè)賴(lài)氨酸位點(diǎn)的功能。的研究表明,NDRG2過(guò)表達(dá)可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。那么我們推測(cè),在結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29細(xì)胞、HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞中,NDRG2對(duì)細(xì)胞增殖的抑制依賴(lài)于HGF/c-MET信號(hào)通路。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)腸道特異性的Ndrg2基因敲除小鼠的小腸和結(jié)腸有明顯的表型變化,提示Ndrg2可能參與了小鼠腸道發(fā)育的調(diào)控過(guò)程。我們將在下一步工作中,致力于揭示NDRG2調(diào)控小鼠小腸和結(jié)腸發(fā)育過(guò)程的分子機(jī)制,進(jìn)一步明確NDRG2的功能。

【目的】(1)闡明NDRG2調(diào)控HGF/c-MET信號(hào)通路抑制HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。(2)構(gòu)建Ndrg2腸上皮細(xì)胞基因特異敲除小鼠,并分析其表型變化。(3)初步明確NDRG2乙?；揎椢稽c(diǎn)及其功能的影響。

【方法】(1)構(gòu)建NDRG2過(guò)表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞株,并以Real-time PCR和Western blot檢測(cè)NDRG2對(duì)HGF、c-MET及其下游分子的影響。(2)構(gòu)建Ndrg2腸上皮細(xì)胞基因特異敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠,通過(guò)Western blot和免疫組化驗(yàn)證NDRG2的敲除效果,并對(duì)基因特異敲除小鼠的表型做初步分析。(3)構(gòu)建NDRG2特定賴(lài)氨酸位點(diǎn)突變的表達(dá)載體,明確對(duì)NDRG2的乙?；揎椝郊捌涔δ艿挠绊憽?/p>

【結(jié)果】(1)NDRG2通過(guò)調(diào)控HGF/c-MET信號(hào)通路,抑制HT29細(xì)胞、HT115細(xì)胞系|人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。HGF激活c-MET和下游分子ERK1/2的磷酸化,上調(diào)下游分子p21和p27的表達(dá),從而抑制HT29細(xì)胞的增殖。而在HT29細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NDRG2可以上調(diào)HGF的表達(dá)和c-MET的磷酸化水平,并調(diào)控下游分子p21和p27的高表達(dá),從而抑制細(xì)胞的增殖。

參考文獻(xiàn)

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