背景及概述^[1]

嵌合抗原受體（CAR）構(gòu)建服務(wù)主要包括嵌合抗原受體（CAR）的構(gòu)建及體外驗(yàn)證等。嵌合抗原受體（CAR）療法是一個(gè)涉及到患者T細(xì)胞基因修飾，進(jìn)而誘導(dǎo)其攻擊腫瘤細(xì)胞的一種個(gè)體化的治療方法。在機(jī)體抗腫瘤免疫治療中，細(xì)胞免疫發(fā)揮了十分重要的作用，但是生理性的T細(xì)胞表面受體識(shí)別腫瘤抗原的模式在很大程度上受到了人體白細(xì)胞抗原的限制，并且對(duì)腫瘤細(xì)胞人體白細(xì)胞抗原分子表達(dá)的下調(diào)與免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，T細(xì)胞表面受體很難在其中發(fā)揮出相應(yīng)的作用。MHC代表個(gè)體特異性的同種異型抗原稱移植抗原或組織相容性抗原，其中能引起強(qiáng)而迅速排斥反應(yīng)的抗原稱主要組織相容性抗原(MHC)。近年來對(duì)免疫應(yīng)答機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，MHC的基因表達(dá)產(chǎn)物MHC分子在免疫應(yīng)答中具有重要的生物學(xué)意義：一方面，MHC分子直接參與抗原提呈細(xì)胞(APC)對(duì)內(nèi)源性或外源性抗原的提呈；另一方面，在TCＲ特異性識(shí)別APC所提呈的抗原肽過程中，必須同時(shí)識(shí)別與抗原肽結(jié)合成復(fù)合物的MHC分子，才能產(chǎn)生T細(xì)胞激活信號(hào)，即MHC限制性。

應(yīng)用^[1]

嵌合抗原受體（CAR）構(gòu)建服務(wù)相關(guān)的免疫治療方法已經(jīng)在臨床上的研究已超過15a?，F(xiàn)階段正在進(jìn)行的臨床實(shí)驗(yàn)有30項(xiàng)之多，研究的內(nèi)容主要包括病毒性疾病、血液系統(tǒng)腫瘤以及實(shí)體瘤等，特別是在血液系統(tǒng)的研究方面，該技術(shù)的發(fā)展十分先進(jìn)。原因在于，多數(shù)血液腫瘤中都有著較為清楚的腫瘤相關(guān)抗原以及腫瘤特異性抗原，為嵌合抗原受體治療方法提供了良好的單鏈以及靶點(diǎn)可變區(qū)。例如，對(duì)于CD123、CD30、CD22、CD20等多個(gè)靶點(diǎn)，已經(jīng)在嵌合抗原受體療法的研究中有所涉及。但是實(shí)體瘤能夠作為設(shè)計(jì)嵌合抗原受體療法的靶點(diǎn)抗原很少，在局部的腫瘤免疫抑制微環(huán)境中，其抗腫瘤效果相對(duì)較差。從CD19嵌合抗原受體所修飾的T細(xì)胞在慢性淋巴細(xì)胞白血病以及非霍奇金淋巴瘤中的發(fā)展過程看，嵌合抗原受體技術(shù)被運(yùn)用得較為恰當(dāng)。對(duì)于多發(fā)性脊髓瘤，嵌合抗原受體治療方法可能會(huì)成為它的主要治療方法，針對(duì)CD56、CD38及CD138甚至胞內(nèi)腫瘤抗原，嵌合抗原受體的研究至今都處于前臨床階段，并且為臨床試驗(yàn)提供了十分珍貴的數(shù)據(jù)。部分臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞能夠根治AML。Ley寡糖抗原是最早被選為嵌合抗原受體治療的AML靶點(diǎn)，并已經(jīng)成功地進(jìn)入到臨床實(shí)驗(yàn)中。參與實(shí)驗(yàn)的患者的病情都在短時(shí)間內(nèi)得到穩(wěn)定，并且均沒有出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng)，這充分說明了Ley寡糖抗原可以作為嵌合抗原受體T細(xì)胞的良好靶點(diǎn)。

構(gòu)建原理^[2]

嵌合抗原受體（CAR）構(gòu)建服務(wù)中嵌合抗原受體（CAR）構(gòu)建與分子生物學(xué)的基因工程免疫受體有關(guān)。簡(jiǎn)單來說，就是將一個(gè)來自某一抗體的輕鏈和重鏈序列的多肽結(jié)構(gòu)，連接于受體上的信號(hào)傳導(dǎo)裝置，如經(jīng)典的T細(xì)胞受體——‘鏈，通過對(duì)其三大區(qū)域(配體結(jié)合域、跨膜結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)信號(hào)域)基本設(shè)計(jì)上的不斷改進(jìn)，從而提高其效能。

1）構(gòu)建CARs信號(hào)域

CARs傳輸一個(gè)信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)的T細(xì)胞需要通過一個(gè)信號(hào)域，經(jīng)典的信號(hào)域?yàn)閏D3鏈，也有人使用來自Fc^y受體的信號(hào)域。第二、三代CARs在初代CARs信號(hào)域CD3的基礎(chǔ)上引入新的信號(hào)域，如CD28、4—1BB或OX40，以期產(chǎn)生共同刺激，使TCR更易被抗原遞呈細(xì)胞(APC)識(shí)別，完全激活T細(xì)胞生理活性。事實(shí)證明，引入共刺激信號(hào)分子這種方式能增加細(xì)因子的產(chǎn)量及促進(jìn)CAR—T細(xì)胞體外增殖，第二代CD19特異性的CARs能攜帶CD28或4—1BB信號(hào)集團(tuán)，且在臨床前模型和B細(xì)胞惡性腫瘤的臨床試驗(yàn)中已經(jīng)證明其具有體內(nèi)抗腫瘤活性”。目前常用的共刺激分子包括CD27、CD28、CD134(OX40)、CD137(4—1BB)、CD244和ICOS等，將其合并在一起能增加∈鏈信號(hào)，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖和存活”。

CD28是個(gè)用于構(gòu)造CARs的共刺激分子，顯著增加了IL一2的產(chǎn)物和細(xì)胞毒性，加入共刺激分子CD28后，通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞能增加CARs對(duì)細(xì)胞毒性的抗性。臨床前實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與CD28共刺激CARs相比，CD137的引入更能改善CARs的體內(nèi)存活，增強(qiáng)其抗腫瘤活性I。而ICOS信號(hào)域過表達(dá)能使人T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Thl7表型，并且在某些情況下與CD28共刺激的Thl7細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更高一級(jí)的抗腫瘤功效。已清楚地發(fā)現(xiàn)引入單一共刺激分子能賦予CAR—T細(xì)胞更高的存活或其他一些T細(xì)胞功能，而較單一共刺激分子相比，增加更多的共刺激分子的確增加了CAR—T細(xì)胞的特性。

2）CARs跨膜域構(gòu)建

配體結(jié)合域通過鉸鏈區(qū)與跨膜域相連，通常來源于CD8和IgG4分子。鉸鏈對(duì)于細(xì)胞表面的CARs表達(dá)非常重要。鉸鏈區(qū)影響scFv的韌性，從而影響其與配基的相互作用。而鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度會(huì)影響T細(xì)胞和標(biāo)靶間的相互作用(取決于目標(biāo)抗原標(biāo)位的位置)，例如，CD22靠近細(xì)胞膜表位較遠(yuǎn)端表位相比會(huì)引起更溶胞作用。同樣，越長(zhǎng)的連接區(qū)域越能增強(qiáng)CARs識(shí)別NCAM和5T4等膜近端表位的能力，還有可能增加其適應(yīng)性。這一發(fā)現(xiàn)很可能揭示了CARs修飾的細(xì)胞和靶向細(xì)胞的距離。

3）CARs結(jié)合域構(gòu)建

研究表明，CAR—T細(xì)胞能識(shí)別和清除相當(dāng)于自身100倍的靶向抗原，如果提高CAR—T細(xì)胞的特異性，會(huì)降低其激活的條件，擴(kuò)大其治療窗。所以說，作為與靶標(biāo)結(jié)合的至關(guān)重要的特異性區(qū)域，CARs配體結(jié)合域的構(gòu)建尤為重要。其構(gòu)建的關(guān)鍵在于如何能只特異性地與靶向細(xì)胞結(jié)合而不影響其他組織器官。目前大多數(shù)已確定的腫瘤特異性抗原是那些在早期胚胎發(fā)育期正常表達(dá)，而在惡性腫瘤中被異常表達(dá)的自身抗原，例如NY—ESO1和MAGE家族抗原。近期發(fā)表在~Cell>>的一項(xiàng)研究中，提出提高CAR—T細(xì)胞靶向特異性和準(zhǔn)確性的一種有效方法是改造它們，使其識(shí)別組合抗原，而Kole等利用基因工程技術(shù)改造了一種需要組合激活的T細(xì)胞回路(Tcellcircuit)。在這一回路中，改造后的T細(xì)胞需要識(shí)別2個(gè)抗原，一種合成Notch受體能識(shí)別其中一個(gè)抗原，被激活后能夠誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)第二個(gè)抗原的CAR表達(dá)，只有在腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)2種抗原的情況下，改造后的T細(xì)胞才會(huì)被激活，研究者將這種T細(xì)胞命名為dual—receptorANDgateTcells。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，這些T細(xì)胞展現(xiàn)出精準(zhǔn)的識(shí)別與治療，能夠區(qū)分出只擁有單個(gè)抗原的非目標(biāo)腫瘤，且有效清除攜帶組合抗原的腫瘤。不同的臨床情況需要不同的scFv、鉸鏈、跨膜區(qū)、刺激和共刺激域。事實(shí)上，迄今仍沒有一個(gè)公認(rèn)的方式來構(gòu)建CARs。關(guān)于CARs的設(shè)計(jì)仍然需要更多的調(diào)查和對(duì)不同惡性腫瘤的臨床評(píng)估。我們也許可以運(yùn)用一些簡(jiǎn)單的克隆技術(shù)替換或改進(jìn)其不同組件，以便于評(píng)估和完善CARs模塊化設(shè)計(jì)。雖然CARs設(shè)計(jì)仍未得到根本解決，但可喜的是，關(guān)于CARs設(shè)計(jì)的新思路卻層出不窮，以其為基礎(chǔ)的新型靶向免疫治療技術(shù)日新月異，如T細(xì)胞受體工程T細(xì)胞(Tcellreceptor—engineeredTcells，TCR—T)、雙特異性T細(xì)胞銜接器(bispecificT—cellengagers，BiTE)和嵌合抗原受體NK細(xì)胞(chimericantigenreeep．torNKcells，CAR—NK)等。這意味著CARs領(lǐng)域的發(fā)展將比經(jīng)典的新型分子藥物更為迅捷，是目前腫瘤免疫治療中炙手可熱的新貴。

主要參考資料

[1]  嵌合抗原受體(CAＲ)技術(shù)在血液腫瘤治療中的研究進(jìn)展

[2] 嵌合抗原受體構(gòu)建與腫瘤治療的研究進(jìn)展