背景[1-7]
KU0063794(mTOR抑制劑)是細(xì)胞通透的，小分子抑制劑，同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2，IC50為10 nM。Ku-0063794抑制Akt，S6K和SGK的活化，以及疏水基團(tuán)的磷酸化，并抑制T環(huán)殘基（Thr308）磷酸化。Ku-0063794還抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期。
與mTOR抑制劑PP242相比,KU-0063794高特異性作用于mTOR,而對(duì)PI3Ks或其他76種激酶則無作用活性。30 nM KU-0063794作用于HEK-293細(xì)胞，通過抑制疏水基團(tuán)(Thr389)磷酸化，及隨后的T-環(huán)殘基(Thr229)磷酸化，而快速切除S6K1活性。300 nM KU-0063794作用于IGF1刺激的血清饑餓處理的HEK-293細(xì)胞，抑制~90%S6K1活性。
KU-0063794為100-300 nM時(shí)，也完全抑制氨基酸誘導(dǎo)的S6K1和S6蛋白磷酸化。與S6K1類似,KU-0063794抑制mTORC1在Ser2448位點(diǎn)磷酸化，也抑制mTORC2在Ser22481位點(diǎn)磷酸化，這種作用存在劑量和時(shí)間依賴性。在血清存在時(shí)，或者IGF1刺激的情況下,KU-0063794抑制Akt活性，或者Akt在Ser473和Thr308（意外的）位點(diǎn)磷酸化，也抑制Akt底物PRAS40在Thr246位點(diǎn)，GSK3α/GSK3β在Ser21/Ser9位點(diǎn)及Foxo-1/3a在Thr24/Thr32位點(diǎn)磷酸化，以上作用存在劑量依賴性。
KU-0063794而不是Rapamycin抑制SGK1活性和在Ser422位點(diǎn)磷酸化，也抑制其生理底物NDGR1，與抑制S6K1和Akt磷酸化程度相似，這種作用存在劑量依賴性，然而KU-0063794不抑制佛波酯誘導(dǎo)的ERK或RSK磷酸化和RSK激活。與Rapamycin相比,KU-0063794更有效誘導(dǎo)4E-BP1在Thr37,Thr46和Ser65位點(diǎn)完全去磷酸化。KU-0063794抑制野生型和mLST8-缺陷型MEFs細(xì)胞生長(zhǎng)，也誘導(dǎo)細(xì)胞周期停在G1期，比Rapamycin效果更顯著。
Ku0063794在腎臟上皮腎細(xì)胞癌的臨床前模型中，抑制腫瘤生長(zhǎng)和mTOR信號(hào)。然而，在動(dòng)物研究中，Ku0063794沒有temsirolimus有效，可能的原因是temsirolimus對(duì)腫瘤的微環(huán)境有重要的作用，能在異種移植瘤中減少血管生成，而Ku0063794無此效果。經(jīng)Temsirolimus處理的腫瘤組織比Ku0063794處理的腫瘤組織更少地表達(dá)VEGF和PDGF。
應(yīng)用[8][9]
KU0063794(mTOR抑制劑)可用于Rictor在血管新生及成熟中的作用機(jī)制研究：
血性疾病如:腦缺血、肢體缺血、心肌缺血等已成為威脅人類健康的殺手之一。目前,促進(jìn)缺血后血管新生,改善側(cè)支循環(huán)來治療缺血性疾病已成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在血管生成至成熟過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells,ECs)起到極其關(guān)鍵的作用。已有相關(guān)研究表明m TOR-Rictor在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用,但其在血管形成至成熟過程中的作用機(jī)制還不明確。
本課題前期研究表明Rictor缺失后,小鼠術(shù)后缺血區(qū)新生血管數(shù)量雖有增加但相對(duì)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞排列絮亂且形態(tài)不規(guī)則。為了驗(yàn)證Rictor在血管成熟中是否發(fā)揮作用及探索其作用機(jī)制,通過利用m TOR阻斷劑KU0063794及m TORC1阻斷劑Rapamycin,缺氧環(huán)境下,細(xì)胞水平間接推測(cè)m TOR-Rictor在缺血后血管成熟中的作用機(jī)制,并通過整體動(dòng)物水平及細(xì)胞水平RNA干擾驗(yàn)證m TOR-Rictor在血管成熟中作用。采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)缺氧條件下加入不同濃度KU0063794及Rapamycin后Akt、p-Akt蛋白表達(dá)變化。
之后檢測(cè)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中Rictor、CX43、PDGF、TGFβ1、Smad3、e NOS、p-e NOS等與血管生成、成熟有關(guān)蛋白表達(dá)變化。KU0063794組在缺氧環(huán)境下,與空白組比較VEGF、ANG1釋放量明顯降低(P<0.05);Rapamycin處理組與空白組相比,VEGF釋放量降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),ANG1釋放量相比空白組差別不大,提示m TOR-Rictor可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放VEGF、ANG1。
缺氧環(huán)境下,較高濃度KU0063794處理組與Rapamycin處理組相比,p-Akt、p-e NOs、TGFβ1、Smad3、CX43、PDGF蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01),提示m TOR-Rictor可促進(jìn)p-Akt、p-e NOs、TGFβ1、Smad3、CX43、PDGF蛋白表達(dá)。(5)sh RNA下調(diào)MAECs中Rictor表達(dá)相對(duì)成功,下調(diào)Rictor后,TGFβ1、CX43、PDGF、Smad3表達(dá)顯著性下降(P<0.05)。QPCR檢測(cè)sh RNA干擾后,Rictor,CX43、TGFβ1基因水平明顯下調(diào),且Rictor下調(diào)后,ANG1釋放減少,實(shí)驗(yàn)結(jié)果加阻斷劑后實(shí)驗(yàn)結(jié)果趨勢(shì)一致。
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