背景及概述^[1]

天然藥物化學(xué)成分提取分離手冊(cè)絞股藍(lán)（Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Makino.）是葫蘆科絞股藍(lán)屬多年生草質(zhì)藤本植物，是目前所知非五加科人參屬植物中唯一含有人參皂苷類成分的植物，素有“南方人參”的美稱。絞股藍(lán)喜陰濕溫和的氣候，廣泛分布于東南亞等地以及我國秦嶺、長江以南各地區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，迄今全世界的絞股藍(lán)共有17個(gè)種和2個(gè)變種。絞股藍(lán)皂苷（gypenoside，Gyp）是絞股藍(lán)中最重要的功能性成分之一，因具有與人參皂苷類似的四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型基本結(jié)構(gòu)而倍受關(guān)注。由于達(dá)瑪烷型皂苷本身具有熱不穩(wěn)定性，在加熱提取過程中易發(fā)生水解，因此，近年來不斷有新的絞股藍(lán)皂苷的報(bào)道，迄今已明確的絞股藍(lán)皂苷共有165個(gè)，苷元有12類。

絞股藍(lán)酮苷A(GypentonosideA)白色粉末狀固體，mp.272℃～274℃，泡沫試驗(yàn)陽性，Liebermann-Burehard反應(yīng)呈黃褐色，Molish反應(yīng)呈棕黃色。研究表明，絞股藍(lán)皂苷具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖、降血脂、保護(hù)肝臟和神經(jīng)等多方面生物活性，且其藥理活性與其側(cè)鏈糖基關(guān)系密切，一般絞股藍(lán)皂苷側(cè)鏈糖基分子越少其活性越高。最新代謝組學(xué)及藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)發(fā)揮藥理作用的絞股藍(lán)皂苷成分主要為含量較少的絞股藍(lán)皂苷單體或不存在于絞股藍(lán)中的次生苷元，值得關(guān)注的是，由于絞股藍(lán)皂苷與人參皂苷的苷元骨架結(jié)構(gòu)相同，部分絞股藍(lán)皂苷在體內(nèi)可以轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷。因此，近年來通過生物轉(zhuǎn)化對(duì)絞股藍(lán)皂苷上的糖基進(jìn)行改造以制備出活性較高的次生皂苷以及高活性的稀有人參皂苷的研究受到國內(nèi)外學(xué)者及制藥企業(yè)廣泛關(guān)注，每年均有許多相關(guān)的研究報(bào)道。

分類^[2]

迄今為止的研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)皂苷大部分具有達(dá)瑪烷型的基本結(jié)構(gòu)，主要由四環(huán)三萜達(dá)瑪烷型皂苷苷元與糖基組成。其C20位上手性中心的絕對(duì)構(gòu)型分為R-構(gòu)型和S-構(gòu)型，其中絞股藍(lán)皂苷Gyp-XXXIX、Gyp-XL、Gyp-XLI、Gyp-LI、Gyp-LIII為R-構(gòu)型，其余均為S-構(gòu)型。隨著研究的深入，越來越多的新型絞股藍(lán)皂苷被發(fā)現(xiàn)，因此，為了更好地開展研究，將絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行系地分類整理就顯得尤為重要。學(xué)術(shù)界主要根據(jù)絞股藍(lán)皂苷苷元結(jié)構(gòu)的相似度對(duì)其進(jìn)行分類，2011年在前人研究基礎(chǔ)上，補(bǔ)充了側(cè)鏈23、24位和25、26位有

共軛雙鍵的苷元類型，將已明確的165個(gè)絞股藍(lán)皂苷按苷元結(jié)構(gòu)相似的程度劃分為12類。其中，絞股藍(lán)皂苷的達(dá)瑪烯雙鍵在24、25位的最多，有102個(gè)；側(cè)鏈21、23位具有環(huán)氧結(jié)構(gòu)的有13種；側(cè)鏈23、24位有雙鍵以及側(cè)鏈具有21-羧酸、21，23-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的各有9種。此外，研究還發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)皂苷的糖基大多連在C3和C20位，主要由葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖構(gòu)成單糖、雙糖和三糖等。隨著研究的深入，越來越多的絞股藍(lán)皂苷被發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)皂苷的苷元分類表也將被補(bǔ)充更新。

^{用途作用[2]}

1. 抗癌作用

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，絞股藍(lán)總皂苷能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW620和食道癌細(xì)胞Eca-109的增殖和遷移，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。而從絞股藍(lán)總皂苷中尋找發(fā)揮主作用的皂苷單體在對(duì)癌癥患者的臨床治療上更具有實(shí)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，在達(dá)瑪烷骨架C20位有游離羥基的絞股藍(lán)皂苷Gyp-XXIII、Gyp-XXIV、Gyp-XXV、Gyp-XXVII、Gyp-XXVIII、Gyp-XXIX和C21位有游離羥基的絞股藍(lán)皂苷Gyp-XXII、Gyp-XXVI對(duì)肝癌、肺癌等多種癌細(xì)胞的增續(xù)表33302018，Vol.39，No.13食品科學(xué)※專題論述殖有明顯抑制作用，但對(duì)正常細(xì)胞無任何影響。Gyp-L能通過引起蛋白質(zhì)的泛素化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致二磷酸肌醇受體Ca2＋釋放，最終導(dǎo)致人食管癌細(xì)胞、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞死亡。

2. 降血脂作用

研究表明，絞股藍(lán)皂苷能有效調(diào)節(jié)血脂的穩(wěn)定性，治療高脂飲食引起的高脂血癥，防止非酒精性脂肪性肝病，并減少腸道對(duì)膽固醇的吸收。值得一提的是，不同含量（40%、80%、98%）的絞股藍(lán)皂苷都能有效降低高脂血癥大鼠血脂水平，且對(duì)肝組織有一定的保護(hù)作用，尤其當(dāng)絞股藍(lán)皂苷含量為98%時(shí)，改善效果更顯著。絞股藍(lán)皂苷Gyp-XVII由于其抗氧化性能，可以通過雌激素受體α介導(dǎo)的PI3K/Akt途徑緩解動(dòng)脈粥樣硬化。

3. 降血糖作用

采用小鼠腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病模型，對(duì)糖尿病小鼠灌胃絞股藍(lán)提取物后發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)皂苷對(duì)糖尿病小鼠有較好的降血糖作用，并能夠提高肝糖原的合成，保護(hù)腎臟。趙濤等[73]通過探討絞股藍(lán)總皂苷對(duì)2型糖尿病大鼠游離脂肪酸代謝的影響及其改善胰島素抵抗的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)絞股藍(lán)總皂苷可明顯改善2型糖尿病中出現(xiàn)的胰島素抵抗，其機(jī)制與絞股藍(lán)總皂苷改善脂代謝紊亂和降血糖的作用有關(guān)。

4. 肝損傷保護(hù)作用

絞股藍(lán)皂苷通過其抗氧化和抗凋亡的生物活性，有效地防止了局部缺血/再灌注誘導(dǎo)的肝損傷、CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。通過使用絞股藍(lán)總皂苷，抑制2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病的大鼠血清中的血清瘦素水平的上升和脂聯(lián)素水平的下降，抑制脂肪肝和肝纖維化。同時(shí)，絞股藍(lán)皂苷通過調(diào)節(jié)肝脂肪生成過程中參與脂肪酸氧化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和脂肪生成酶，輔助治療非酒精性脂肪性肝病，從而提高總體預(yù)。其中，抑制線粒體通路介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡是絞股藍(lán)總皂苷抗肝纖維化的重要機(jī)制之一。

5. 抗氧化作用

對(duì)不同純化條件下（總皂苷A：30%；總皂苷B：50%；總皂苷A′：總皂苷A經(jīng)硅膠柱層析后得到）得到的絞股藍(lán)皂苷樣品的體外抗氧化能力進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，30%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液洗脫出的皂苷純化樣品的體外抗氧化能力最強(qiáng)而測定發(fā)現(xiàn)40%乙醇溶液分離物的抗氧化活性最強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同與洗脫方案不同有關(guān)，若在30%～40%乙醇溶液間增加幾個(gè)洗脫梯度，可得到較準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)論?；诮g股藍(lán)皂苷顯著的抗氧化活性，對(duì)絞股藍(lán)皂苷進(jìn)行皮膚的抗氧化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有延緩細(xì)胞衰老的作用。

6. 神經(jīng)保護(hù)作用

絞股藍(lán)皂苷具有改善抑郁癥和焦慮癥等神經(jīng)障礙，治療帕金森、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病和保護(hù)視神經(jīng)等作用。絞股藍(lán)皂苷Gyp-XVII通過激活PI3K/Akt、Nrf2/ARE/HO-1通路和GSK-3β的失活，抑制β-淀粉樣蛋白25～35引起的神經(jīng)毒性損傷。進(jìn)一步研究其潛在機(jī)制發(fā)現(xiàn)，Gyp-XVII通過激活轉(zhuǎn)錄因子EB對(duì)阿爾茨海默病的細(xì)胞和嚙齒類動(dòng)物模型起到保護(hù)的作用。抑郁癥和焦慮癥的發(fā)生與單胺類物質(zhì)減少有關(guān)，絞股藍(lán)皂苷可抑制焦慮性障礙的產(chǎn)生并保護(hù)由1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶缺陷而產(chǎn)生神經(jīng)毒性的帕金森大鼠模型。此外，絞股藍(lán)總皂苷還有防止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡、改善視神經(jīng)炎患者的視力、治療中風(fēng)和促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化等神經(jīng)保護(hù)作用。

7.其他

絞股藍(lán)皂苷還能改善和治療缺血再灌注引起的大鼠心臟功能的損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞和大腦中動(dòng)脈閉塞的細(xì)胞，加速口腔潰瘍的愈合、調(diào)節(jié)代謝、抗運(yùn)動(dòng)疲勞和增強(qiáng)機(jī)體免疫等。其中，絞股藍(lán)皂苷Gyp-TN-2和Gyp-LXXIV能夠抑制莨菪堿處理小鼠的記憶力和學(xué)習(xí)障礙。

制備^[3]

絞股藍(lán)皂苷的提取主要是根據(jù)極性相似相溶原理，選用對(duì)目標(biāo)組分溶解度大，對(duì)不需要組分溶解度小的溶劑，并輔助一定的破壁措施將絞股藍(lán)皂苷從絞股藍(lán)組織細(xì)胞提取出來。目前已有報(bào)道的絞股藍(lán)皂苷提取方法有溶劑熱提取、超聲波提取、酶法提取、微波提取、超臨界流體萃取及超高壓提取。其中超臨界流體萃取及超高壓提取可以作為絞股藍(lán)皂苷提取的重點(diǎn)研究內(nèi)容。

1.溶劑熱提取

絞股藍(lán)皂苷含有多個(gè)糖基，極性較大，可溶于水、甲醇、乙醇等溶劑，因此溶劑熱提取絞股藍(lán)皂苷時(shí)，常用水提和醇提，采取煎煮、回流提取、索氏提取等措施。水提法因其工藝簡單、成本較低、無溶劑污染，而被作為粗提的常用方法，通過考察料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)水提效果的影響，在化條件下絞股藍(lán)皂苷得率為7.79%，純度為26.85%。但水提取液中常含有無機(jī)鹽、糖、蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)，另外水提液還常含有黏液，濃縮時(shí)易產(chǎn)生泡沫，給下一步濃縮分離帶來困難。為了克服單純水提的弊端，提高提取液的穩(wěn)定性，采用一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甲醇、乙醇分別提取絞股藍(lán)皂苷，比較了80%甲醇、75%乙醇提取絞股藍(lán)總皂苷的不同效果，通過測定發(fā)現(xiàn)75%乙醇和80%甲醇提取效果明顯高于水提，且乙醇提取效果高于甲醇，如用乙醇回流提取絞股藍(lán)皂苷可獲得更優(yōu)提取效果。

2. 超聲波提取

超聲波的作用是輔助溶劑提取，彌補(bǔ)單純?nèi)軇崽崛∑票诓焕硐氲娜毕?。超聲波的空化效?yīng)及引起的一系列次級(jí)效應(yīng)能實(shí)現(xiàn)破壁、加速提取成分的擴(kuò)散釋放的作用。另外，超聲波也可以轉(zhuǎn)化為熱能加快樣品中有效成分的擴(kuò)散速度，從而更高效、快速提取植物細(xì)胞內(nèi)容物。利用超聲法提取絞股藍(lán)皂苷，可以大大縮短提取時(shí)間，并提高絞股藍(lán)皂苷的浸出率，且隨著超聲時(shí)間的延長皂苷提取率相應(yīng)提高，但并不是無限提高，所以選擇合適的超聲時(shí)間也很重要。

3. 酶法提取

絞股藍(lán)的細(xì)胞壁主要是由纖維素和果膠組成，而皂苷等有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，目前絞股藍(lán)皂苷酶法提取工藝主要是利用纖維素酶及果膠酶破壞細(xì)胞壁組成成分，增加絞股藍(lán)皂苷的溶出率，從而提高提取率。纖維素酶可以破壞β-D-葡萄糖苷鍵連接，從而使植物細(xì)胞壁破壞，減小有效成分的溶出阻力。利用纖維素酶法提取絞股藍(lán)總皂苷，將絞股藍(lán)粉碎至120目，酶用量0.4%、酶解溫度45℃提取時(shí)間為150min、提取溫度為50℃等條件下，絞股藍(lán)總皂苷提取率為3.81%。同樣采用纖維素酶提取絞股藍(lán)總皂苷，在工藝條件下，絞股藍(lán)總皂苷提取率達(dá)4.60%，與熱水浸提法相比提取率提高了17.05%。果膠酶能夠破壞絞股藍(lán)細(xì)胞壁中的果膠物質(zhì)，同纖維素酶一樣有破除細(xì)胞壁加快皂苷溶出的效果。

4. 微波提取

微波提取由于能對(duì)提取體系中的不同組分進(jìn)行選擇性加熱，因此具有較好的選擇性，且熱效率高、升溫快速均勻，可大大提高提取物純度，方便分離后處理。該技術(shù)大多作為輔助措施用于天然產(chǎn)物的水提、醇提。但微波提取應(yīng)用于提取絞股藍(lán)皂苷的文獻(xiàn)較少，僅南昌大學(xué)的郭輝力等相對(duì)系統(tǒng)地研究過以微波輔助提取絞股藍(lán)皂苷，提出了微波干法預(yù)處理-乙醇快速浸泡提取的新工藝，并與傳統(tǒng)的乙醇回流提取進(jìn)行比較，不僅提取時(shí)間縮短了近9h，提取率也提高了15.8%。此工藝較直接用溶劑浸泡進(jìn)行微波輻射，能有效避免絞股藍(lán)細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)加熱與微波能被溶劑消耗而造成破壁不理想的情況出現(xiàn)，這樣既可提高微波提取效率，節(jié)省能源，又可簡化微波提取裝置，降低投入成本，利于工業(yè)化生產(chǎn)。

5. 超臨界CO2萃取

由于超臨界CO2只能有效地萃取親脂性物質(zhì)，對(duì)相對(duì)質(zhì)量分子較大、羥基多、極性較大的皂苷類物質(zhì)提取其產(chǎn)率普遍較低，需要加入夾帶劑、表面活性劑以及其他強(qiáng)化措施來提高產(chǎn)率。為了提高皂苷率，采用超聲強(qiáng)化超臨界CO2萃取人參皂苷，與單純的超臨界CO2萃取相比超聲的加入能明顯提高超臨界CO2萃取人參皂苷的萃取率和生產(chǎn)效率，這可能是由于超聲的破碎細(xì)胞壁作用導(dǎo)致溶質(zhì)擴(kuò)散阻力減小，增加了與超臨界流體的接觸面積。之后他又將特定的表面活性劑、乙醇和水形成反相微乳液引入到超臨界CO2體系中增加對(duì)皂苷的溶解度，并與乙醇/水/超臨界CO2萃取進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其萃取率是乙醇/水/超臨界CO2萃取的3.2倍。除了采取強(qiáng)化措施來提高超臨界CO2萃取皂苷的萃取率和生產(chǎn)效率外，也應(yīng)該注意萃取前樣品的制備和預(yù)處理，比如樣品粒度、樣品的裝填密度、樣品溶液的酸堿度等都影響溶質(zhì)的擴(kuò)散速度和皂苷的存在形式從而影響皂苷得率及皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

6. 超高壓提取

超高壓提取的升壓、保壓、卸壓過程能夠加速溶劑與細(xì)胞基質(zhì)間的擴(kuò)散、滲透、溶解，使提取速率大大提高，提取時(shí)間大大縮短。雖然利用超高壓提取絞股藍(lán)中皂苷的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道，但超高壓在人參皂苷提取方面的成果可以作為重要參照。在超高壓技術(shù)提取人參皂苷方面成果較多，他們探討了不同提取溶劑、溶劑濃度、提取壓力、溶劑與原料比、提取時(shí)間等因素對(duì)皂苷得率的影響，并將超高壓提取法與回流提取、超聲提取、微波提取、超臨界CO2萃取等方法進(jìn)行了比較，研究發(fā)現(xiàn)超高壓在提取具有提取率高、溶雜少、能耗低、操作方便、快速等優(yōu)點(diǎn)，而且超高壓是在常溫下操作，能程度地保留生物活性物質(zhì)及各種營養(yǎng)成分的天然結(jié)構(gòu)，避免了因熱效應(yīng)引起的有效成分變性、損失、藥理活性降低等問題，同時(shí)超高的壓力也使絕大多數(shù)細(xì)菌失活，有利于產(chǎn)品的保藏。另外，在一定壓力下所產(chǎn)生的凝聚作用可以打破酶和基質(zhì)間的隔離，使酶活上升，加速酶促反應(yīng)。繼續(xù)提高壓力，既可以增加皂苷溶出率又可以改變酶蛋白的結(jié)構(gòu)而起到鈍酶的作用，防止內(nèi)容物過多溶出，增加后續(xù)純化的難度。超高壓如果輔助酶法提取，既可充分發(fā)揮酶的催化活性，又可充分利用超高壓破壁、鈍酶的作用，雙重作用增強(qiáng)破壁效果。綜上可以看出，超高壓提取完全可以作為絞股藍(lán)皂苷提取的重要研究方向。雖然超高壓有諸多優(yōu)勢(shì)，但仍面臨一些實(shí)際問題，如提取工藝參數(shù)的協(xié)同效應(yīng)、有限的提取容積、設(shè)備的產(chǎn)能、設(shè)備投資費(fèi)用等。

參考資料

[1] 化學(xué)詞典

[2] 絞股藍(lán)皂苷生物轉(zhuǎn)化與活性的研究進(jìn)展

[3] 絞股藍(lán)皂苷提取純化工藝研究進(jìn)展