背景及概述[1]
甲狀旁腺激素(PTH)是一種由甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的，調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣和磷代謝的多肽類激素，其C端肽鏈與PTH-II受體結(jié)合可促進(jìn)骨細(xì)胞凋亡、N端肽鏈與PTH-I受體結(jié)合可促進(jìn)骨骼重m.建。Lilly公司以人甲狀旁腺素(hPTH)N-末端34個(gè)氨基酸殘基研制的用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物特立帕肽(Teriparatide)于2002年12月被FDA批準(zhǔn)上市。阿巴帕肽是由34個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，分子式為C174H300N56O49，分子量為3960.64g/mol，CAS號(hào)為247062-33-5，專利公開了阿巴帕肽的制備方法，首先采用固相合成的方法合成3個(gè)肽樹脂片段，隨后將肽片段2和3與肽樹脂片段1進(jìn)行連接。然而該方法肽片段2和3進(jìn)行縮合之前需要凍干過程，并且肽樹脂片段2和3的生成需要使用大量昂貴的2-CTC樹脂，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。因此，亟待開發(fā)一種過程簡(jiǎn)單、成本低，且產(chǎn)品收率高的阿巴帕肽的制備方法。
應(yīng)用[2]
阿巴帕肽，英文名稱為Abaloparatide，是由Radius Health公司研制的一種新型甲狀旁腺激素相關(guān)肽(PTHrP)，它是PTH-I受體強(qiáng)有力的選擇性激活劑，可以增加骨礦物質(zhì)含量、骨密度以及骨強(qiáng)度，促進(jìn)骨骼形成， 已于2017年4月28日被FDA批準(zhǔn)上市，其商品名稱為Tymlos。阿巴帕肽經(jīng)皮下注射，用于治療處于骨折風(fēng)險(xiǎn)或?qū)ζ渌委熕幬餆o(wú)效的絕經(jīng)后婦女的骨質(zhì)疏松癥，可有效降低新發(fā)椎體和非椎體骨折率。與特立帕肽相比，阿巴帕肽能夠更好的降低骨折率和高鈣血癥發(fā)生率。
制備[1]
一種阿巴帕肽的制備方法：
步驟1：二肽片段Fmoc-Leu-Leu-OH的制備
1)Fmoc-Leu-OSu的合成：將0.1mol Fmoc-Leu-OH和0.11mol HOSu溶于0.2L的THF，置于冰水浴，得混合液Ⅰ；將0.11mol DCC溶于0.1L的THF中，并滴至混合液Ⅰ中，滴加完畢繼續(xù)反應(yīng)1h后，將溫度升至25℃，保溫反應(yīng)3h后，將反應(yīng)液過濾、蒸干，再加DCM溶解過濾、蒸干，得固體Ⅰ；加乙酸乙酯將固體Ⅰ溶解后、進(jìn)行重結(jié)晶，得到Fmoc-Leu-OSu。2)Fmoc-Leu-Leu-OH的合成：將0.12mol H-Leu-OH和0.12mol Na2CO3溶于0.2L體積分?jǐn)?shù)50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅱ；將Fmoc-Leu-OSu溶于THF中，并滴加至混合溶液Ⅱ中，25℃過夜反應(yīng)后，將反應(yīng)液旋蒸，加入體積分?jǐn)?shù)15％檸檬酸調(diào)pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有機(jī)相后，用飽和NaCl溶液洗滌3次，加無(wú)水Na2SO4過夜干燥，蒸干溶劑，得固體Ⅱ；再用乙酸乙酯將固體Ⅱ溶解后、進(jìn)行重結(jié)晶，得到Fmoc-Leu-Leu-OH。
步驟2）Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的制備
1)Fmoc-Arg(Pbf)-OSu的合成：將0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-OH和0.11mol HOSu溶于0.2L的THF中，至于冰水浴，得混合液Ⅰ；將0.11mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅰ中，滴加完畢繼續(xù)反應(yīng)1h后，將溫度升至25℃，保溫反應(yīng)3h后，將反應(yīng)液過濾、蒸干，再加DCM溶解過濾、蒸干，得固體Ⅰ；加乙酸乙酯將固體Ⅰ溶解后、進(jìn)行重結(jié)晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-OSu。2)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的合成：將0.12mol H-Arg(Pbf)-OH和0.12molNa2CO3溶于0.2L體積分?jǐn)?shù)50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅱ；將Fmoc-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅱ中，25℃過夜反應(yīng)后，將反應(yīng)液旋蒸，加入體積分?jǐn)?shù)15％檸檬酸調(diào)pH至3，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有機(jī)相后，用飽和NaCl溶液洗滌3次，加無(wú)水Na2SO4過夜干燥，蒸干溶劑，得固體Ⅱ；用乙酸乙酯將固體Ⅱ溶解后、進(jìn)行重結(jié)晶，得到Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。3)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu的合成：將0.1mol Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH和0.11mol HOSu溶于2L的THF中，至于冰水浴，得混合液Ⅲ；將0.11mol DCC溶于0.1L THF中，并滴加至混合液Ⅲ中，滴加完畢繼續(xù)反應(yīng)1h后，將溫度升至25℃，保溫反應(yīng)3h后；將反應(yīng)液過濾、蒸干，再加DCM溶解過濾、蒸干，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu。4)Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH的合成：將0.12mol H-Arg(Pbf)-OH和0.12molNa2CO3溶于0.2L體積分?jǐn)?shù)50％THF/H2O溶液，得混合液Ⅳ；將Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OSu溶于THF中，并滴加至混合液Ⅳ中，25℃過夜反應(yīng)后，將反應(yīng)液旋蒸，加入體積分?jǐn)?shù)15％檸檬酸調(diào)pH至3，乙酸乙酯萃取3次，合并3次萃取的有機(jī)相后，用飽和NaCl溶液洗滌3次，加無(wú)水Na2SO4過夜干燥，蒸干溶劑，得Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH。
步驟3：阿巴帕肽-氨基樹脂的制備
1)Fmoc氨基樹脂溶脹：取20g替代度為0.5mmol/g的RinkAmide MBHA樹脂，加入200mL DCM或DMF將樹脂溶脹0.5h，抽干溶劑后，再用DMF洗滌樹脂兩次，抽干溶劑，得氨基樹脂固體Ⅰ。2)Fmoc氨基樹脂脫Fmoc保護(hù)：向步驟1)制得的氨基樹脂固體Ⅰ中，加入200mL體積比為1:4的哌啶和DMF組成的去保護(hù)溶液，在25℃條件下進(jìn)行兩次脫Fmoc保護(hù)：次脫Fmoc保護(hù)和第二次脫Fmoc保護(hù)，次脫Fmoc保護(hù)時(shí)間為5min，第二次脫Fmoc保護(hù)時(shí)間為10min后，再用DMF洗滌氨基樹脂pH至7，抽干溶劑，得脫保護(hù)的氨基樹脂。3)氨基酸和肽片段活化：分別將Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH各30mmol與縮合體系：30mmolHOBT和30mmol DIC，用適量的DMF溶解，在25℃條件下反應(yīng)5min，得活化后的氨基酸和肽片段。4)縮合：將步驟3)制得的活化后的氨基酸和活化后的肽片段加至步驟2)制得的脫除Fmoc保護(hù)基的氨基樹脂中，在25℃條件下進(jìn)行氨基酸的縮合反應(yīng)2h，茚三酮顯色反應(yīng)監(jiān)控縮合反應(yīng)進(jìn)程，逐步縮合活化后的保護(hù)氨基酸和肽片段：按照阿巴帕肽主鏈肽序從C端至N端依次縮合的全保護(hù)氨基酸和肽片段順序?yàn)镕moc-Ala-OH、Fmoc-Thr(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Leu-Leu-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH；最終得線性全保護(hù)阿巴帕肽-氨基樹脂Ala-Val-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Leu-His(Trt)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asp(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Glu(OtBu)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Aib-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Thr(OtBu)-Ala-RinkAmide MBHA樹脂；樹脂增重率92％。上述茚三酮顯色方法：取少量樹脂至于試管中，DMF洗滌兩次，在試管中分別加入一滴體積分?jǐn)?shù)5％茚三酮-乙醇溶液、一滴體積分?jǐn)?shù)85％苯酚-乙醇溶液和一滴吡啶后，于120℃條件下加熱2min后，再用DMF洗滌兩次后，觀察樹脂顏色。5)肽樹脂收縮：將步驟4)制得的肽樹脂用500mL MeOH和500mLDCM交替洗滌三次，5min/次，抽干溶劑，真空干燥，得阿巴帕肽樹脂。
步驟4：阿巴帕肽粗肽的制備
向制得的阿巴帕肽樹脂中加入其10倍體積的裂解試劑，在25℃條件下反應(yīng)3h后，抽濾，將濾液加至其10倍體積預(yù)冷的乙醚中進(jìn)行沉淀、離心，再用乙醚將沉淀洗滌四次，真空干燥得到阿巴帕肽粗肽，裂解試劑為TFA、苯甲硫醚、TIS、EDT和H2O的混合溶劑，其中體積比為TFA:苯甲硫醚:TIS:EDT:H2O＝90:5:2:2:1。經(jīng)檢測(cè)阿巴帕肽粗肽純度為90％。
步驟5：阿巴帕肽粗肽的純化
對(duì)制得的阿巴帕肽粗肽進(jìn)行純化、凍干，得阿巴帕肽純品多肽，具體如下：采用反相高效液相色潽法對(duì)阿巴帕肽粗肽進(jìn)行純化；反相高效液相色潽法的色譜條件為：反相C18柱，先用流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1％TFA-H2O溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1％TFA-ACN溶液，將所要的組分收集濃縮；再采用流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1％乙酸-H2O溶液，流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1％乙酸-ACN溶液；兩步均為梯度洗脫：流速為80mL/min，洗脫時(shí)間為60min，洗脫梯度流動(dòng)相B相體積百分?jǐn)?shù)為10％～60％，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，對(duì)阿巴帕肽純品換鹽，將所需要的組分收集濃縮，凍干，得阿巴帕肽產(chǎn)品。
主要參考資料
[1] CN201910172437.6 一種阿巴帕肽的制備方法
[2] CN201810099339.X 一種阿巴帕肽的制備方法