背景[1-3]
磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基可用于細(xì)菌的甲基紅和V-P試驗(yàn)。多胨提供碳氮源、維生素和生長因子;葡萄糖為可發(fā)酵的糖類;磷酸氫二鉀是緩沖劑;氯化鈉維持均衡的滲透壓。
甲基紅(MR)試驗(yàn)：腸桿菌科的細(xì)菌在糖代謝過程中，分解葡萄糖，產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸再被分解，生成甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸。大腸桿菌分解丙酮酸，次生的酸類較多，pH為4.5或更低，甲基紅呈現(xiàn)紅色(陽性)。在產(chǎn)氣桿菌的培養(yǎng)液中一部分丙酮酸變?yōu)橹行缘囊阴＜谆状?，生成的酸類較少，pH在5.4以上，甲基紅呈現(xiàn)桔黃色(陰性)。
乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)(V—P試驗(yàn))：細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖生成丙酮酸，某些細(xì)菌可使丙酮酸脫羧形成乙酰甲基甲醇。在堿性溶液中，乙酰甲基甲醇可在空氣中氧化成二乙酰(丁二酮)。二乙酰再與蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成紅色化合物。試驗(yàn)中加入α—萘酚是作催化劑，使反應(yīng)的顏色加深，提高反應(yīng)的敏感性。
應(yīng)用[4][5]
用于用M-PCR檢測閩江流域表面水體中病原性大腸桿菌的毒素基因研究
以閩江流域表體水面中分離出的大腸桿菌為材料,經(jīng)膜過濾法(membrane filtration method)結(jié)合mFC—BCIG培養(yǎng)基的方法來分離糞大腸桿菌,并使用乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基和磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基來對(duì)其進(jìn)行生化檢測,最終確定單位體積水樣中糞大腸桿菌的數(shù)量,然后將糞大腸桿菌菌株制成PCR模板同時(shí)甘油保存。
研究結(jié)果表明:對(duì)閩江流域從上游到下游7個(gè)斷面進(jìn)行了大腸桿菌的分離、鑒定和12種毒素基因的多重PCR檢測。在鑒定的1231株糞大腸桿菌中檢出10種毒素基因,其中具有擴(kuò)散性黏附素(aidA-1)毒素基因的大腸桿菌占總數(shù)的12.99%,熱不穩(wěn)定腸毒素(elt)和熱穩(wěn)定腸毒素(astA)數(shù)量次之(分別占總數(shù)的5.8%和5.4%),還檢測出了少數(shù)高危菌株的主要致病因子,例如志賀氏毒素(Stx2e)和耐藥性因子(sepA)等。分別于不同季節(jié)在閩江流域福州過境段的洪山橋和解放大橋斷面采取水樣,進(jìn)行大腸桿菌的分離、鑒定。
用多重PCR方法對(duì)不同季節(jié)分離的大腸桿菌毒素基因的時(shí)空分布進(jìn)行定性與定量分析。從分離的2015株糞大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)840株潛在的致病性大腸桿菌,分別屬于腸出血性大腸桿菌(EHEC)、腸聚集性大腸桿菌(EAEC)、腸致病性大腸桿菌(EPEC)和腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)。
檢出的10種毒素基因中,以擴(kuò)散性黏附素基因(aidA-1)、熱穩(wěn)定性腸毒素基因(astA)和耐藥性因子(sepA)為最多;細(xì)菌總量、大腸桿菌總數(shù)和致病性大腸桿菌總數(shù)在冬季較低,春季較多,夏秋季節(jié)達(dá)到全年數(shù)量的高峰;潛在的致病性大腸桿菌的毒素基因的種類和數(shù)量也是在冬季最少,春夏季上升,秋季最多。
使用多重PCR(multiplex PCR)的方法對(duì)糞大腸桿菌菌株中的毒素基因(virulence gene)進(jìn)行檢測,為閩江河的污染現(xiàn)狀和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。
參考文獻(xiàn)
[1]Analysis of the AIDA-I gene sequence and prevalence in Escherichia coli isolates from pigs with post-weaning diarrhoea and oedema disease[J].Lixiang Zhao,Xiang Chen,Xiaojing Xu,Gao Song,Xiufan Liu.The Veterinary Journal.2007(1)
[2]Molecular characteristics of Escherichia coli serogroup O78 strains isolated from diarrheal cases in bovines urge further investigations on their zoonotic potential[J].Mol.Nutr.Food Res..2004(7)
[3]Cloning of the Pneumocystis jirovecii trifunctional FAS gene and complementation of its DHPS activity in Escherichia coli[J].Peter Iliades,Daniel J.Walker,Laura Castelli,Jacqueline Satchell,Steven R.Meshnick,Ian G.Macreadie.Fungal Genetics and Biology.2004(12)
[4]DNA inoculation with a plasmid vector carrying the faeG adhesin gene of Escherichia coli K88ab induced immune responses in mice and pigs[J].Carlos Gil Turnes,JoséAntonio G.Aleixo,Alegani Vieira Monteiro,Odir A.Dellagostin.Vaccine.1999(15)
[5]黃文文.用M-PCR檢測閩江流域表面水體中病原性大腸桿菌的毒素基因[D].福建師范大學(xué),2009.