背景^[1-3]

LLC小鼠肺癌細(xì)胞是從小鼠肺癌組織中分離并培養(yǎng)成的穩(wěn)定原代細(xì)胞系，商品化的小鼠肺癌細(xì)胞LLC主要來源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、LLC小鼠肺癌細(xì)胞promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC等細(xì)胞系。

原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取組織或器官的一部分進(jìn)行培養(yǎng)，也稱初代培養(yǎng)。嚴(yán)格地說即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到次傳代階段，但實際上，通常把代至第十代以內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)。一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動，可見細(xì)胞分裂，但不旺盛。原代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。由于培養(yǎng)的細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。

LLC小鼠肺癌細(xì)胞

細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入250px皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.收到細(xì)胞后首次傳代推薦將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含6ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，建議客戶凍存一支備用，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2到1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。

應(yīng)用^[4][5]

用于抑制Rac1減輕小鼠放射性肺損傷并增敏肺癌放療的作用與機(jī)制研究

針對Rac1在胸部放療所致肺損傷中的作用進(jìn)行研究,從動物和細(xì)胞兩個水平觀察抑制Rac1對放射性肺損傷的防護(hù)效果,另一方面驗證其對腫瘤放療的影響。并進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組測序及分析,篩選并驗證Rac1下游的作用分子,從而闡明Rac1與放射性肺損傷及腫瘤放療關(guān)系的作用機(jī)制。

探索抑制Rac1對放射性肺損傷的防護(hù)作用及機(jī)制,驗證抑制Rac1對正常肺組織與腫瘤細(xì)胞的差異效應(yīng),探索介導(dǎo)該差異效應(yīng)的分子機(jī)制。

方法:使用60Co放射源,構(gòu)建放射性肺損傷小鼠模型,使用Rac1特異性抑制劑NSC23766和H&E染色、Masson染色方法,研究抑制Rac1對模型小鼠照射后肺組織肺炎、肺纖維化程度的影響,并通過免疫組織化學(xué)染色法研究抑制Rac1對模型小鼠照射后肺組織DNA損傷標(biāo)志物磷酸化H2AX（γ-H2AX）、放射損傷標(biāo)志物TGF-β和EMT標(biāo)志物vimentin的表達(dá)影響。

使用小鼠正常肺上皮細(xì)胞系MLE-12,使用Rac1特異性抑制劑NSC23766及構(gòu)建Rac1敲除細(xì)胞系的方式,通過免疫蛋白印跡法（Western Blot,WB）研究放射后凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)變化,通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率、PI/RNase染色法檢測細(xì)胞周期分布、Ed U法檢測細(xì)胞增殖活力,從細(xì)胞水平上驗證抑制Rac1對放射性肺損傷的保護(hù)效應(yīng)。通過轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ふ乙种芌ac1引起的差異基因表達(dá),篩選抑制Rac1介導(dǎo)其效應(yīng)的可能通路,實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）法驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,從細(xì)胞水平上研究介導(dǎo)Rac1差異作用的分子機(jī)制。

進(jìn)一步利用小鼠肺癌細(xì)胞系LLC研究抑制/敲除Rac1對腫瘤細(xì)胞的輻射增敏效應(yīng)。最后,構(gòu)建裸鼠皮下荷瘤模型、小鼠肺部原位荷瘤模型,結(jié)合使用Rac1抑制劑NSC23766,進(jìn)一步在體驗證抑制Rac1對正常肺組織與腫瘤細(xì)胞的雙向作用。

研究結(jié)果:（1）Rac1抑制劑NSC23766可減輕小鼠放射性肺炎及肺纖維化;（2）抑制或敲除Rac1對MLE-12細(xì)胞的增殖活力無明顯影響,可減少M(fèi)LE-12細(xì)胞照射后凋亡、逆轉(zhuǎn)MLE-12細(xì)胞照射后G2/M期阻滯、減輕MLE-12細(xì)胞照射后DNA損傷;（3）敲除Rac1可下調(diào)腫瘤蛋白p53誘導(dǎo)核蛋白1（Tumor protein p53-inducible nuclear protein 1,Trp53inp1）,過表達(dá)Trp53inp1可部分逆轉(zhuǎn)敲除Rac1對MLE-12的輻射防護(hù)效應(yīng);（4）抑制或敲除Rac1可顯著抑制LLC細(xì)胞增殖活力、增加LLC細(xì)胞照射后凋亡,對LLC細(xì)胞照射后周期阻滯無明顯影響;（5）過表達(dá)Trp53inp1可協(xié)同敲除Rac1的促LLC凋亡效應(yīng),對小鼠肺癌細(xì)胞周期及增殖活力無明顯影響;（6）腫瘤細(xì)胞LLC的Rac1表達(dá)顯著高于正常肺上皮細(xì)胞MLE-12,且存在Rac1插入突變;（7）腫瘤細(xì)胞LLC的Trp53inp1表達(dá)顯著低于正常肺上皮細(xì)胞MLE-12;

參考文獻(xiàn)

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[5]安妮.抑制Rac1減輕小鼠放射性肺損傷并增敏肺癌放療的作用與機(jī)制[D].中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué),2020.