背景[1-3]
人脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(AFABP)ELISA試劑盒可以特異性檢測(cè)樣本中人脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(AFABP)的含量。
實(shí)驗(yàn)原理：人脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(AFABP)ELISA試劑盒是采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）。往預(yù)先包被人脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aFABP)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過(guò)溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aFABP)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。
人脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(AFABP)ELISA試劑盒
標(biāo)本要求
1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。
2.血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。
3.尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔先加待測(cè)樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
結(jié)果判斷
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線(xiàn)性回歸曲線(xiàn)，按曲線(xiàn)方程計(jì)算各樣本濃度值。
應(yīng)用[4][5]
用于脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP4）抑制心肌細(xì)胞收縮的機(jī)制研究
研究的數(shù)據(jù)表明,盡管結(jié)構(gòu)與FABP3高度相似,但FABP4對(duì)心肌細(xì)胞收縮能力的抑制作用幾乎不依賴(lài)于心肌細(xì)胞內(nèi)鈣釋放的調(diào)控。由來(lái)自FABP4氨基末端的前20個(gè)氨基酸構(gòu)成的FABP4衍生小肽（The first 20 amino acids from the N terminus of FABP4,FABP4-P20）同樣能夠以濃度依賴(lài)性的方式抑制心肌細(xì)胞的收縮,但是FABP4-P20卻能夠抑制小鼠心肌細(xì)胞鈣瞬變,與FABP3類(lèi)似。進(jìn)一步鑒定了FABP4-P20中的關(guān)鍵氨基酸,發(fā)現(xiàn)E15K突變使FABP4-P20對(duì)于心肌細(xì)胞收縮的抑制作用降低了50%。
將為抗心衰藥物的研發(fā)提供新的理論依據(jù)。
方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)使用飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中的健康C57BL/6小鼠,12-14周齡。2.利用IonOptix單細(xì)胞動(dòng)緣檢測(cè)系統(tǒng)（IonOptix video-based edgedete-ction）檢測(cè)細(xì)胞的收縮功能。3.通過(guò)鈣成像技術(shù)研究小鼠心室肌細(xì)胞鈣瞬變的動(dòng)力學(xué)變化。4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和相關(guān)分析。數(shù)據(jù)用MEAN±SE表示,采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析,檢驗(yàn)以P<0.05為差異有顯著性意義。
結(jié)果:1 FABP4抑制小鼠心室肌細(xì)胞興奮-收縮偶聯(lián)的特性。1.1 FABP4以劑量依賴(lài)性方式抑制小鼠心室肌細(xì)胞的細(xì)胞縮短幅度,曲線(xiàn)擬合數(shù)據(jù)提示FABP4對(duì)于心室肌細(xì)胞收縮的抑制有兩個(gè)親和力不同的作用機(jī)制。低親和力機(jī)制的EC50為0.120 nmol/L,高親和力機(jī)制的EC50約為0.010 pmol/L。
1.2 FABP4以劑量依賴(lài)性方式抑制小鼠心室肌細(xì)胞中的鈣瞬變。1.2.1 FABP4抑制小鼠心室肌細(xì)胞的鈣瞬變幅度,但僅在極高濃度下,EC50為0.412 nmol/L。1.2.2 FABP4抑制小鼠心室肌細(xì)胞的鈣回收,但僅在極高濃度下,EC50為1.312 nmol/L。2 FABP4衍生小肽FABP4-P20抑制心室肌細(xì)胞收縮特性的研究。
2.1 FABP4-P20以劑量依賴(lài)的方式抑制細(xì)胞縮短。曲線(xiàn)擬合數(shù)據(jù)提示FABP4-P20對(duì)于心室肌細(xì)胞收縮的抑制只保留了低親和力作用機(jī)制,EC50為0.110 nmol/L。2.2 FABP4-P20以劑量依賴(lài)的方式抑制小鼠心室肌細(xì)胞中鈣瞬變幅度,與FABP4相比抑制作用升高約3倍,EC50為1.860 nmol/L。2.3 FABP4-P20以劑量依賴(lài)的方式抑制小鼠心室肌細(xì)胞中的鈣回收,與FABP4相比抑制作用升高約7倍,EC50為1.564 nmol/L。2.4 E15K突變減弱FABP4-P20對(duì)細(xì)胞縮短的抑制約50%,表明氨基端第15位的谷氨酸對(duì)FABP4-P20的這種抑制功能至關(guān)重要。
結(jié)論:1.FABP4主要通過(guò)鈣非依賴(lài)性途徑抑制心肌細(xì)胞的收縮,且有兩個(gè)親和力不同的作用機(jī)制。2.FABP4衍生小肽FABP4-P20僅保留了FABP4的低親和力抑制作用,但是顯示出了與FABP3相似的抑制鈣調(diào)控的作用。3.氨基端第15位的谷氨酸是FABP4-P20收縮抑制功能的關(guān)鍵位點(diǎn)。
參考文獻(xiàn)
[1]An Overview and Update on Obesity and the Obesity Paradox in Cardiovascular Diseases[J].Andrew Elagizi,Sergey Kachur,Carl J.Lavie,Salvatore Carbone,Ambarish Pandey,Francisco Ortega,Richard V.Milani.Progress in Cardiovascular Diseases.2018
[2]Early Diagnostic Performance of Heart-Type Fatty Acid Binding Protein in Suspected Acute Myocardial Infarction:Evidence From a Meta-Analysis of Contemporary Studies[J].Li-Qian Xu,Yun-Mei Yang,Hong Tong,Chang-Fu Xu.Heart,Lung and Circulation.2018(4)
[3]Heart-type fatty acid binding protein is a sensitive biomarker for early AMI detection in troponin negative patients:a pilot study[J].Luisa Agnello,Giulia Bivona,Giuseppina Novo,Concetta Scazzone,Roberto Muratore,Piero Levantino,Chiara Bellia,Bruna Lo Sasso,Marcello Ciaccio.Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory I.2017(6)
[4]Heart-type fatty acid-binding protein as a diagnostic biochemical marker for early detection of myocardial infarction[J].Hamza,Demerdash,Ibrahim.Acta Cardiologica.2016(5)
[5]王翠華.脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白（FABP4）抑制心肌細(xì)胞收縮的機(jī)制[D].河北醫(yī)科大學(xué),2019.