急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是一種常見的突發(fā)且嚴重的臨床事件，其特點是腎功能迅速喪失和進展的慢性纖維化，發(fā)病率和死亡率高[1]。臨床上，缺血再灌注（Ischemia-reperfusion，IR）損傷是導致AKI的主要原因之一[2,3]。目前，還沒有確證有效可以預防或減弱AKI的藥物[4]。
IR破壞細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，觸發(fā)腎臟中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量生成，造成線粒體損傷，導致炎癥、凋亡和壞死[5]。因此，ROS是治療IR誘導AKI的潛在關(guān)鍵靶點之一。核因子紅系因子2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid factor-2-related factor 2，Nrf2）通過調(diào)節(jié)抗氧化基因的表達在許多炎癥和氧化應激條件下發(fā)揮保護作用[6,7]，研究表明，Nrf2通過抑制氧化應激可顯著減輕腦、心、肝臟、腎臟IR損傷[8-11]。
甲基丁香酚（methyl eugenol，ME）是酚類化合物丁香酚的類似物，是許多芳香植物的天然成分，具有抗癌、抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛和抗焦慮性等作用，此外，ME可誘導Nrf2活化[12]，表明ME在腎臟氧化應激損傷中可能發(fā)揮作用。
2022年7，華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院宮念樵教授課題組在Acta Pharmacologica Sinica發(fā)表了題為“Methyl eugenol protects the kidney from oxidative damage in mice by blocking the Nrf2 nuclear export signal through activation of the AMPK/GSK3β axis”的文章，揭示了ME通過活化AMPK/GSK3β軸，促進Nrf2核內(nèi)聚集，進而減輕IR誘導的腎臟氧化應激損傷；ME干預可顯著抑制急性氧化損傷后的進行性腎纖維化。該研究為應用ME預防氧化應激相關(guān)疾病，特別是為腎臟IR損傷的治療提供了新的見解和深入的理論依據(jù)。
研究者首先檢測了不同給藥劑量條件下ME對AKI的保護效果，通過檢測小鼠腎功能改變，確定有效且相對安全的給藥劑量（20 mg/kg）后，觀察各組小鼠生存率發(fā)現(xiàn)，治療組可顯著提高IR誘導的AKI小鼠生存率、減輕急性腎小管壞死、降低腎損傷相關(guān)分子（kidney injury molecule-1，KIM-1）的表達（圖1）。
圖1 ME減輕腎臟IR損傷
（圖源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
為了驗證ME對腎臟氧化應激的作用，課題組檢測了干預組與非干預組小鼠腎臟氧化應激水平，結(jié)果表明，IR損傷會引起顯著氧化應激及線粒體損傷，而ME干預可明顯降低8-OhdG熒光強度及腎組織中MDA含量，提高SOD活性，減輕線粒體損傷（圖2）。
圖2 ME減輕IR誘導的腎臟氧化應激損傷
（圖源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
此外，課題組在體外的HK-2細胞缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷模型中，同樣發(fā)現(xiàn)ME預處理可顯著減輕H/R損傷誘導的氧化應激損傷，穩(wěn)定線粒體膜電位，減少細胞凋亡。為驗證ME是否通過Nrf2發(fā)揮作用，課題組通過對體內(nèi)、體外模型中Nrf2蛋白水平的檢測發(fā)現(xiàn)，ME可顯著升高Nrf2水平，給予Nrf2的特異性抑制劑ML385可顯著抑制Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平，削弱ME的腎臟保護作用。進一步通過蛋白印跡法及Nrf2免疫組化和熒光染色檢測Nrf2胞質(zhì)/胞核蛋白水平，結(jié)果顯示ME處理可顯著提高Nrf2核內(nèi)蛋白水平（圖3）。
圖3 ME對腎IR損傷的保護作用依賴于Nrf2的核內(nèi)聚集
（圖源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
Nrf2在細胞核內(nèi)與活化反應原件結(jié)合后促進下游靶基因轉(zhuǎn)錄，進而發(fā)揮作用。研究表明，作為應激感受器的AMPK可調(diào)控GSK3β進而抑制GSK3β/Fyn通路影響的Nrf2核內(nèi)蛋白水平[13]。為驗證ME對AMPK/GSK3β的調(diào)控，課題組分別采用AMPK和GSK3β特異性抑制劑復合物C、DIF-3進行干預，結(jié)果表明ME可促進AMPK的磷酸化，導致GSK3β磷酸化進而抑制Nrf2的出核。油紅O脂肪染色及LC3/LAMP1雙熒光染色進一步表明，ME可調(diào)控AMPK進而正向調(diào)控脂質(zhì)氧化及自噬。分子對接結(jié)果顯示，ME可與AMPK高親和力結(jié)合。以上結(jié)果表明，ME通過AMPK/GSK3β通路發(fā)揮腎臟保護作用，AMPK可能是ME的潛在作用靶點（圖4）。
圖4 ME活化AMPK/GSK3β軸，阻斷Nrf2出核，進而發(fā)揮保護作用
（圖源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
臨床上溫和的、可逆的AKI更為常見，為此，課題組建立了缺血25min的非致死的腎損傷模型，觀察ME的治療效果。動態(tài)觀察小鼠腎臟功能，結(jié)果顯示，ME干預組小鼠腎功能恢復明顯快于模型組，ME干預可顯著降低術(shù)后第30天小鼠腎臟α平滑肌肌動蛋白水平，減輕腎臟纖維化面積（圖5）。
圖5 ME減輕IR誘導的腎臟纖維化進展
（圖源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
圖6 ME與AMPK高親和力結(jié)合，激活AMPK/GSK3β軸，導致Nrf2核內(nèi)聚集，從而增強其下游抗氧化基因轉(zhuǎn)錄，減輕腎臟氧化應激損傷。
（圖源：BC Kuang, et al., Acta Pharmacol Sin, 2022）
文章結(jié)論與討論，啟發(fā)與展望
綜上所述，該研究證明了甲基丁香酚（ME）通過AMPK/GSK3β軸調(diào)控Nrf2的胞質(zhì)-核轉(zhuǎn)位，導致Nrf2核內(nèi)聚集，從而增強其抗氧化靶基因轉(zhuǎn)錄以保護腎臟免受氧化損傷（圖6）。本研究為應用ME預防氧化應激相關(guān)疾病，特別是為腎臟缺血再灌注IR損傷的治療提供了新的見解和深入的理論依據(jù)。另外，Nrf2核內(nèi)聚集也受到其他信號通路的影響，既往研究報道Nrf2 N端Neh2結(jié)構(gòu)域Ser40位點磷酸化可促進Keap1/Nrf2ME解離和Nrf2核轉(zhuǎn)位[14,15]，該研究揭示了ME通過AMPK/GSK3β軸調(diào)控Nrf2活性，減輕腎臟氧化應激損傷，然而，Nrf2磷酸化水平及ME與AMPK的直接作用位點尚未深入研究；ME能否靶向Nrf2負調(diào)控因子Keap1并影響其活性，尚需進一步研究。
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