背景^[1-3]

大鼠細胞色素P450(CYP450)ELISA KIT用于檢測血液、血清、胸腹水等其他體液中細胞色素P450(CYP450)的含量。

實驗原理：大鼠細胞色素P450(CYP450)ELISA KIT是采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被細胞色素P450(CYP450))捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細胞色素P450(CYP450)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

大鼠細胞色素P450(CYP450)ELISA KIT

標本要求

1.血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

2.血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3.尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4.細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

操作流程

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

應用^[4][5]

大鼠細胞色素P450(CYP450)ELISA KIT用于大鼠肝臟細胞色素P450酶水平對何首烏肝毒性的影響

考察大鼠肝臟細胞色素P450酶水平對何首烏肝毒性的影響。

方法:采用雄性的SD大鼠,200±10g,隨機將大鼠分為六組,分別是:空白對照組(a)、何首烏對照組(b)、CYP1A2抑制對照組(c)、CYP2E1抑制對照組(d)、何首烏+CYP1A2抑制組(e)、何首烏+CYP2E1抑制組(f);單次灌胃何首烏水提物實驗:CYP1A2抑制對照組(c)、何首烏+CYP1A2抑制組(e)組于灌胃何首烏前5d開始腹腔注射CYP1A2抑制劑西咪替丁50mg/kg BW,CYP2E1抑制對照組(d)、何首烏+CYP2E1抑制組(f)組于灌胃何首烏前2.5h腹腔注射CYP2E1抑制劑反式1,2-二氯乙烯100mg/kg BW,何首烏對照組(b)、何首烏+CYP1A2抑制組(e)、何首烏+CYP2E1抑制組(f)組單次灌胃何首烏水提物40g/kg BW,并于給藥后2h、4h、24h、48h和72h眼眶取血;長期反復間隔灌胃何首烏水提物:CYP1A2抑制對照組(c)、何首烏+CYP1A2抑制組(e)組于灌胃何首烏前5d開始腹腔注射CYP1A2抑制劑西咪替丁50mg/kg BW(連續(xù)抑制,間隔,再次抑制,再次間隔,再次抑制),CYP2E1抑制對照組(d)、何首烏+CYP2E1抑制組(f)組于灌胃何首烏前2.5h腹腔注射CYP2E1抑制劑反式1,2-二氯乙烯100mg/kg BW(連續(xù)抑制,間隔,再次抑制,再次間隔,再次抑制),何首烏對照組(b)、何首烏+CYP1A2抑制組(e)、何首烏+CYP2E1抑制組(f)組灌胃何首烏水提物40g/kg BW,連續(xù)1w,間隔2w,再次給藥1d,再間隔3w,再次給藥3d,每次灌胃何首烏后2h取血測大鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶AST(天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,谷草轉(zhuǎn)氨酶)和ALT(丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶,谷丙轉(zhuǎn)氨酶)活性,“cocktail”探針藥物法測肝微粒體5種細胞色素P450酶活性,肝臟組織切片并HE染色,分析肝臟病理學切片。

結果:單次灌胃何首烏水提物:每日觀察、測體重,大鼠會出現(xiàn)怠動、毛色不華等狀況,體重在24h之內(nèi)下降;2h、4h、24h、48h、72h連續(xù)取血測定,大鼠肝臟轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST在24h之內(nèi)受到影響,在2h時ALT和AST顯著升高,4h、24h分別是AST、ALT顯著升高。長期反復間隔灌胃何首烏水提物:連續(xù)灌胃1w,ALT和AST顯著升高,間隔2w再次給藥1d,ALT和AST再次顯著升高,再次間隔3w,再次給藥3d,ALT和AST再次顯著升高;實驗結束后檢測各組肝微粒體酶活性,結果何首烏對照組的CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9、CYP2D6活性均明顯下調(diào),CYP1A2抑制劑對照組的CYP1A2活性明顯下調(diào),CYP2E1抑制劑對照組的CYP2E1和CYP2C9活性明顯下調(diào),何首烏+CYP1A2組主要表現(xiàn)CYP1A2和CYP2D6活性下調(diào),何首烏+CYP2E1組主要表現(xiàn)CYP2E1和CYP2D6活性下調(diào)、及CYP3A4酶活性的上調(diào);各組大鼠的肝臟病理學分析發(fā)現(xiàn),與各對照組相比,CYP1A2或CYP2E1抑制劑預處理加何首烏灌胃處理組有明顯肝臟損傷。

結論:大鼠肝臟細胞色素P450酶活性水平與何首烏所致肝損傷有關,抑制肝細胞中CYP1A2和CYP2E1的表達可致何首烏相關大鼠急性肝毒性。

參考文獻

[1]Drug-Induced Idiosyncratic Hepatotoxicity:Prevention Strategy Developed after the Troglitazone Case[J].Toshihiko Ikeda.Drug Metabolism and Pharmacokinetics,2011(1)

[2]Genetic polymorphism of CYP1A2 and the toxicity of leflunomide treatment in rheumatoid arthritis patients[J].Petra Bohanec Grabar;;Bla?Rozman;;Matija Tom?i?;;Da?a?uput;;Du?an Logar;;Vita Dol?an.European Journal of Clinical Pharmacology,2008(9)

[3]Troglitazone-induced liver failure:a case study[J].David J Graham;;Lanh Green;;John R Senior;;Parivash Nourjah.The American Journal of Medicine,2003(4)

[4]Cytochrome P450 enzyme polymorphisms and adverse drug reactions[J].Munir Pirmohamed;;B.Kevin Park.Toxicology,2003(1)

[5]葛珍珍.大鼠肝臟細胞色素P450酶水平對何首烏肝毒性的影響[D].北京中醫(yī)藥大學,2014.