背景[1-3]
JF305人胰腺癌細(xì)胞來源于人胰腺，呈上皮細(xì)胞樣，貼壁生長。
JF305人胰腺癌細(xì)胞細(xì)胞特性：
1）來源：胰腺
2）形態(tài)：上皮細(xì)胞樣，貼壁生長
3）規(guī)格：1×106cells
4）培養(yǎng)條件：1640+10%FBS+1%P/S；空氣，95%；二氧化碳，5%，37℃。
JF305人胰腺癌細(xì)胞
JF305人胰腺癌細(xì)胞接收后的處理：
1）收到細(xì)胞后，活細(xì)胞首先觀察培養(yǎng)瓶是否完好，培養(yǎng)液是否漏液，培養(yǎng)基是否渾濁；凍存細(xì)胞是否干冰已揮發(fā)完，凍存管蓋是否脫落，破碎，若有這類情況，請務(wù)必拍照記錄，并于收貨24h內(nèi)與我們聯(lián)系。
2）細(xì)胞處理：
復(fù)蘇的細(xì)胞：如果是T-25培養(yǎng)瓶活細(xì)胞，收到后請用75%的酒精對培養(yǎng)瓶表面進(jìn)行消毒處理，然后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱中靜置2~3h后再進(jìn)行后續(xù)處理。
JF305人胰腺癌細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程：
1、細(xì)胞復(fù)蘇
1）配制完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）細(xì)胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細(xì)胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺(tái)中，化凍的細(xì)胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到細(xì)胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察細(xì)胞貼壁情況（未貼壁的即為死細(xì)胞--針對貼壁細(xì)胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、細(xì)胞傳代
1）待細(xì)胞生長到80%-90%匯合度時(shí)，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無菌PBS潤洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細(xì)胞消化時(shí)間不同），取出細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞至細(xì)胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使細(xì)胞脫落下來成單個(gè)細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于15ml無菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集細(xì)胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細(xì)胞生長速度調(diào)整比例），分別加入到2個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、細(xì)胞凍存
1）按照細(xì)胞傳代方法，在超凈工作臺(tái)內(nèi)消化收集細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計(jì)數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個(gè)/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過夜后，轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
用途[4][5]
JF305人胰腺癌細(xì)胞可以用于DPC4基因?qū)θ艘认侔┘?xì)胞JF305生長和增殖的影響
通過研究腫瘤抑制基因DPC4對人胰腺癌細(xì)胞系JF305生物學(xué)行為的影響,探討DPC4基因抑制胰腺癌生長的機(jī)制,為此癌的基因治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法：選擇無DPC4表達(dá)的人胰腺癌細(xì)胞系JF305為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞,采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將pBK-CMV-DPC4質(zhì)粒導(dǎo)入JF305中,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pBK-CMV的JF305細(xì)胞為陰性對照,未轉(zhuǎn)染的JF305為空白對照,并以含G418 400μg/ml的DMEM進(jìn)行篩選培養(yǎng),收集上述三種細(xì)胞,提取總RNA,采用RT-PCR法檢測上述三種細(xì)胞中DPC4的表達(dá);通過測定細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞周期、細(xì)胞粘附率和細(xì)胞集落形成率檢測人胰腺癌細(xì)胞系中JF305轉(zhuǎn)染DPC4前后生長、增殖等生物學(xué)行為的改變。
結(jié)果：經(jīng)G418選擇性培養(yǎng)后只有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pBK-CMV-DPC4和pBK-CMV的JF305細(xì)胞仍然存活。轉(zhuǎn)染pBK-CMV-DPC4的JF305細(xì)胞有DPC4基因表達(dá),而未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞無表達(dá)。通過細(xì)胞記數(shù)和MTT法測定發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pBK-CMV-DPC4的JF305細(xì)胞增殖能力同轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的JF305細(xì)胞相比明顯受到抑制,細(xì)胞倍增時(shí)間顯著延長,G1期細(xì)胞數(shù)所占比例明顯增加,G2/M期細(xì)胞數(shù)所占比例明顯下降,細(xì)胞克隆形成率和貼壁率均明顯下降,兩者差異顯著,P<0.001。
結(jié)論：DPC4轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系JF305后,JF305可穩(wěn)定表達(dá)DPC4。DPC4可使JF305細(xì)胞的G1期細(xì)胞明顯增多,G2/M期細(xì)胞明顯減少,而且明顯抑制其生長和增殖能力,明顯降低其增殖潛力和生存能力。表明DPC4的缺失與胰腺癌的發(fā)病關(guān)系密切,可能是胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的一個(gè)重要的分子事件。DPC4可能成為胰腺癌基因治療的重要靶位基因。
參考文獻(xiàn)
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