背景[1-3]
ADAM10抗體是針對ADAM10蛋白的特異性抗體。ADAM10是哺乳動物ADAM家族中的一種金屬蛋白酶-去整合素，它在多種生物過程中發(fā)揮關鍵作用，尤其是在切割特定的膜結合分子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、Notch受體及其配體delta的過程中起到重要作用。
ADAM10抗體是一種針對解聚素和金屬蛋白酶10(A Disintegrin and Metalloproteinase 10，簡稱ADAM10)的特異性抗體。ADAM10是一種膜結合的金屬蛋白酶，它在多種生理和病理過程中起著關鍵作用，包括細胞粘附、遷移、分化、信號傳導以及蛋白質(zhì)的切割和釋放。
ADAM10能夠切割多種蛋白質(zhì)，如TNF-α（腫瘤壞死因子-α）和E-鈣粘蛋白。具體來說，ADAM10在76-ala-|-val-77處將TNF-α的膜結合前體切割成其成熟的可溶形式。此外，ADAM10還負責幾種其他細胞表面蛋白的蛋白水解釋放，包括ephrin-a2，以及淀粉樣前體蛋白的組成型和受調(diào)節(jié)的α-分泌酶切割。同時，它也參與細胞朊病毒蛋白的正常切割，以及細胞表面粘附分子L1的切割和膜囊泡的釋放，這表明ADAM10具有基于囊泡的蛋白酶活性。
ADAM10抗體
在阿爾茨海默病（AD）的發(fā)病機制中，ADAM10發(fā)揮著特別重要的作用。作為主要的α-分泌酶，ADAM10能夠促進淀粉樣前體蛋白（APP）的非淀粉樣肽代謝途徑，減少β-淀粉樣蛋白（Aβ）的產(chǎn)生，同時增加具有神經(jīng)保護作用的sAPPα的產(chǎn)生。sAPPα在神經(jīng)元可塑性/存活中發(fā)揮重要作用，對興奮性毒性有神經(jīng)保護作用。
ADAM10抗體的應用非常廣泛。這種抗體已被測試并應用于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫組織化學和蛋白質(zhì)印跡等多種實驗方法，以識別和研究ADAM10的表達和定位。通過使用這種抗體，研究人員可以更深入地了解ADAM10在生物體中的作用，從而推動相關領域的研究進展。
應用[4][5]
ADAM10抗體可以用于Kenpaullone通過SHMT2促進ADAM10翻譯并改善阿爾茨海默病的病理
KEN通過ADAM10 5’UTR促進ADAM10的翻譯目的:探究小分子藥物KEN處理數(shù)種細胞后其ADAM10蛋白表達的變化并探究其作用機制。
方法:1.利用ADAM10抗體WB技術,觀察藥物KEN及其結構類似物Alsterpaullone和同為CDK/GSK3抑制劑的AT7519處理細胞后,其ADAM10蛋白表達的變化。
2. 藥物KEN分別處理數(shù)種類型的細胞后,利用ADAM10抗體WB技術檢測細胞ADAM10蛋白水平的變化。
3. SH-SY5Y細胞經(jīng)小分子藥物KEN的時間梯度和濃度梯度的處理后ADAM10抗體WB技術探究其最合適的作用時間和濃度。
4. SH-SY5Y細胞在適宜濃度和時間的KEN作用下,ADAM10抗體免疫熒光技術檢測其與對照組相比的ADAM10蛋白表達強度。
5. CCK-8試劑盒檢測不同濃度的KEN對SH-SY5Y細胞活性的影響。
6. WB技術探究KEN對SHSY5Y-APP細胞APP蛋白及分泌型蛋白s APPα表達的作用。
7. ELISA實驗探究SHSY5Y-APP細胞在KEN處理后,其分泌的細胞外Aβ1-42在處理組和對照組之間的差異。
8. 使用q-PCR技術探究KEN對SH-SY5Y細胞的m RNA表達是否有影響。
9. 使用轉(zhuǎn)錄抑制劑Act D、翻譯抑制劑CHX、蛋白酶體抑制劑MG132、溶酶體抑制劑CQ和翻譯起始因子復合物競爭性抑制劑4EGI-1作用于細胞,ADAM10抗體WB技術觀察其是否能阻斷KEN對ADAM10的表達促進作用。
10. 將CDK5和GSK3β的si RNA轉(zhuǎn)染到細胞中,ADAM10抗體WB技術觀察其是否能阻斷KEN對ADAM10的表達促進作用。
11. 將包含或不包含5’UTR片段的ADAM10質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中,WB技術觀察KEN的有效作用片段。
12. 將包含有ADAM10啟動子和5’UTR片段的序列克隆到PGL4.17的熒光素酶報告基因質(zhì)粒中,然后將各個片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中,與對照組(Ctrl)相比,觀察各處理組的熒光素強度。
結果:1.SH-SY5Y細胞在不同濃度的三種試劑(KEN、Alsterpaullone、AT7519)作用下,只有KEN與對照組相比明顯增加了細胞ADAM10蛋白的表達(**P<0.01)。2.SH-SY5Y細胞在KEN的時間梯度(0-48小時)作用下,處理36小時的條件下細胞ADAM10蛋白表達增加最明顯(**P<0.01)。
3.人源性的HEK-293細胞、小鼠的傳代海馬神經(jīng)元HT22、小鼠的原代神經(jīng)元在不同濃度(0-2.0μM)的KEN作用下,細胞的ADAM10蛋白表達增加(**P<0.01)。
4.ADAM10抗體免疫熒光觀察到的結果同WB:SH-SY5Y細胞在恰當?shù)臅r間和濃度的KEN作用下ADAM10蛋白表達增加(**P<0.01)。
5.不同濃度的KEN(0-2.0μM)對細胞活性的影響無統(tǒng)計學意義。
6.SHSY5Y-APP細胞在750 n M的KEN作用36小時后與對照組(Ctrl)相比,分泌型蛋白s APPα明顯增加(**P<0.01),而APP蛋白表達變化無統(tǒng)計學意義。
7.SHSY5Y-APP細胞在750 n M的KEN作用36小時后與對照組(Ctrl)相比,其分泌的Aβ1-42明顯減少(*P<0.05)。
8.SH-SY5Y細胞在750 n M的KEN作用36小時后,其ADAM10m RNA水平和對照組相比無明顯變化(P>0.05)。
9.有效濃度的翻譯抑制劑CHX和翻譯起始因子復合物競爭性抑制劑4EGI-1作用于細胞后,可以阻斷KEN對ADAM10的蛋白表達促進作用。
10.敲低CDK5和GSK3β后,不影響KEN對細胞ADAM10的蛋白表達促進作用。11.KEN促進包含5’UTR片段細胞的ADAM10蛋白表達(**P<0.01),而對不含有5’UTR片段的細胞沒有影響。
結論:1.KEN可以促進多種細胞的ADAM10蛋白表達。2.SH-SY5Y細胞在750 n M的KEN作用36小時的條件下,ADAM10蛋白增加最明顯。3.有效濃度的KEN對細胞活性幾乎無影響。4.SH-SY5Y細胞在750 n M的KEN作用36小時后,ADAM10抗體WB檢測其培養(yǎng)基中的分泌型蛋白s APPα明顯增加。5.KEN在轉(zhuǎn)錄后水平以依賴5’UTR的方式對ADAM10的蛋白表達進行調(diào)控。
參考文獻
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