介紹

N-甲基-N-亞硝基苯胺（N-Nitroso-N-methylaniline，NMA）是一種典型的芳香族N-亞硝胺類化學(xué)致癌物，具有顯著的器官特異性致癌效應(yīng)，可特異性誘導(dǎo)大鼠食管腫瘤與小鼠肺腫瘤的發(fā)生，慢性染毒下大鼠腫瘤發(fā)生率接近100%?；罨腘MA可與脫氧鳥(niǎo)苷3'-單磷酸（dGp）、脫氧腺苷3'-單磷酸（dAp）形成共價(jià)加合物，且對(duì)dGp的修飾效率是dAp的23倍以上。

圖一 N-甲基-N-亞硝基苯胺

致癌性

N-甲基-N-亞硝基苯胺的致癌性于20世紀(jì)70年代被首次證實(shí)。Druckrey等學(xué)者通過(guò)慢性染毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1.8或2.1mmol/kg劑量的NMA可誘導(dǎo)BD大鼠食管腫瘤發(fā)生率接近100%，同時(shí)可引發(fā)小鼠肺組織腫瘤，展現(xiàn)出極強(qiáng)的器官靶向致癌能力。后續(xù)研究進(jìn)一步證實(shí)，NMA的致癌效應(yīng)依賴于肝臟微粒體CYP酶系的代謝活化，其α-C羥基化代謝產(chǎn)物可自發(fā)分解生成苯重氮離子（BDI），而該離子被認(rèn)為是NMA發(fā)揮致癌效應(yīng)的核心活性中間體。

代謝活化與失活

N-甲基-N-亞硝基苯胺的致癌效應(yīng)完全依賴于體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，其代謝途徑主要由CYP酶系介導(dǎo)，分為活化致癌與解毒失活兩條平行路徑，其中CYP2B1是調(diào)控兩條代謝途徑的核心同工酶。實(shí)驗(yàn)采用苯巴比妥（PB）預(yù)處理的大鼠肝微粒體（富含CYP2B1，CYP含量達(dá)2.97nmol/mg蛋白）進(jìn)行代謝研究，證實(shí)該酶系可高效催化NMA的氧化反應(yīng)，超過(guò)30%的底物可在10min內(nèi)被氧化代謝。

代謝活化

α-C羥基化是NMA發(fā)揮致癌效應(yīng)的必經(jīng)途徑，該過(guò)程由CYP2B1特異性催化。N-甲基-N-亞硝基苯胺分子中與N-亞硝基相連的甲基發(fā)生羥基化，生成不穩(wěn)定的α-羥基-N-亞硝基-N-甲基苯胺中間體。該中間體在生理?xiàng)l件下無(wú)需酶催化即可自發(fā)分解，釋放出甲醛，同時(shí)生成高活性的苯重氮離子（BDI），這也是NMA的終極致癌活性代謝產(chǎn)物。代謝體系中可檢測(cè)到苯酚的生成，而苯酚是BDI水解的特征產(chǎn)物，加入BDI特異性捕獲劑1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮后，苯酚的生成量可下降50%，代謝過(guò)程中產(chǎn)生了BDI。CYP2B1的特異性抑制劑可劑量依賴性抑制NMA的N-去甲基化反應(yīng)（α-C羥基化的特征反應(yīng)），其中美替拉酮、金剛烷、金剛烷烴均可顯著抑制甲醛的生成，且抑制效率與CYP2B1的結(jié)合親和力呈正相關(guān)，證實(shí)CYP2B1是NMAα-C羥基化的核心催化酶。

圖二 經(jīng)苯巴比妥預(yù)處理的大鼠微粒體對(duì)NMA的氧化代謝

代謝失活

除活化途徑外，N-甲基-N-亞硝基苯胺還可通過(guò)CYP2B1介導(dǎo)的脫亞硝基反應(yīng)進(jìn)行代謝解毒。該過(guò)程中，NMA的N-N鍵發(fā)生斷裂，生成苯胺、N-甲基苯胺、對(duì)甲基氨基酚與亞硝酸鹽，無(wú)法生成致癌性的BDI，因此被公認(rèn)為NMA的代謝失活途徑。PB誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體代謝NMA后，體系中可穩(wěn)定檢出苯胺、對(duì)氨基酚等脫亞硝基產(chǎn)物，其生成量可被CYP2B1抑制劑顯著抑制，進(jìn)一步證實(shí)該過(guò)程同樣由CYP2B1同工酶介導(dǎo)。兩條代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，決定了NMA在體內(nèi)的致癌效應(yīng)強(qiáng)度：當(dāng)α-C羥基化途徑占優(yōu)時(shí)，BDI生成量增加，致癌風(fēng)險(xiǎn)顯著升高；當(dāng)脫亞硝基途徑占優(yōu)時(shí)，NMA被快速解毒，致癌效應(yīng)隨之降低。

致癌的分子機(jī)制

采用PB誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體活化N-甲基-N-亞硝基苯胺，分別與脫氧腺苷3'-單磷酸（dAp）、脫氧鳥(niǎo)苷3'-單磷酸（dGp）進(jìn)行孵育，通過(guò)核酸酶P1增強(qiáng)版32P后標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)?；罨腘MA與dAp、dGp孵育后，均在聚乙烯亞胺（PEI）-纖維素薄層色譜上檢出單一的加合物放射性斑點(diǎn)；而對(duì)照組（無(wú)微粒體活化體系、無(wú)脫氧核苷酸底物）均未檢出任何加合物信號(hào)，說(shuō)明只有經(jīng)CYP2B1代謝活化的NMA，才能與脫氧核糖核苷酸形成共價(jià)加合物。

加合物形成具有顯著的堿基偏好性。通過(guò)相對(duì)加合物標(biāo)記值（RelativeAdductLabeling,RAL）進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，活化N-甲基-N-亞硝基苯胺對(duì)dGp的修飾效率（RAL=1.54±0.23/10?），是對(duì)dAp修飾效率（RAL=0.065±0.010/10?）的23倍以上。這一結(jié)果表明，鳥(niǎo)嘌呤是NMA致癌的主要靶堿基，鳥(niǎo)嘌呤加合物是其引發(fā)基因突變的核心DNA損傷類型。

BDI與腺嘌呤反應(yīng)生成的N?-腺嘌呤三氮烯加合物，本身具有酸不穩(wěn)定性，在核酸提取、酶解的弱酸性環(huán)境中易發(fā)生分解。而B(niǎo)DI與鳥(niǎo)嘌呤反應(yīng)可生成穩(wěn)定的8-苯偶氮鳥(niǎo)嘌呤加合物，該產(chǎn)物在酸性與中性環(huán)境中均能穩(wěn)定存在?；诖?，研究推測(cè)N-甲基-N-亞硝基苯胺代謝生成的BDI，主要與鳥(niǎo)嘌呤的C8位發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，生成8-苯偶氮鳥(niǎo)嘌呤加合物，這也是其最主要的致癌相關(guān)DNA損傷。

DNA加合物的致癌生物學(xué)

N-甲基-N-亞硝基苯胺代謝生成的BDI與DNA堿基形成的共價(jià)加合物，可通過(guò)多種途徑引發(fā)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，最終誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。穩(wěn)定的鳥(niǎo)嘌呤加合物可在DNA復(fù)制過(guò)程中阻礙DNA聚合酶的正常堿基配對(duì)，引發(fā)G→T、G→C顛換突變，這類突變是原癌基因（如Ras家族）激活、抑癌基因（如p53）失活的常見(jiàn)突變類型，是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)事件；不穩(wěn)定的腺嘌呤加合物分解后，會(huì)形成脫嘌呤位點(diǎn)與DNA單鏈斷裂，若損傷無(wú)法被精準(zhǔn)修復(fù)，會(huì)引發(fā)基因組不穩(wěn)定性，進(jìn)一步加速細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化進(jìn)程；其三，BDI還可與細(xì)胞內(nèi)的RNA、蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，干擾蛋白質(zhì)的正常功能與基因的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞的惡性表型形成[1]。

參考文獻(xiàn)

[1] STIBOROVá M, SCHMEISER H H, WIESSLER M, et al. Direct evidence for the formation of deoxyribonucleotide adducts from carcinogenic N-nitroso-N-methylaniline revealed by the 32P-postlabeling technique [J]. Cancer Letters, 1999, 138 (1-2): 61-66. DOI:10.1016/S0304-3835 (98) 00369-3.