維生素B12測定用培養(yǎng)基是一種專門設(shè)計的、不含維生素B12的營養(yǎng)基質(zhì)，用于通過微生物法精確檢測樣品中維生素B12的含量。在嬰幼兒食品和乳制品中，維生素B12的含量是衡量其營養(yǎng)價值的重要指標(biāo)之一。由于維生素B12在食品中含量極微，且需要檢測其生物活性，微生物法被公認(rèn)為仲裁方法^[2]。

檢測原理

微生物法測定維生素B12的原理，是利用萊士曼氏乳酸桿菌（Lactobacillus leichmannii）對維生素B12的高度特異性。在維生素B12測定用培養(yǎng)基中，除維生素B12外，菌株生長所需的所有氨基酸、碳源、鹽類及其他維生素均已完備供給。因此，菌株的生長量（通過濁度或吸光度反映）完全依賴于外界添加的維生素B12量^[2]。

維生素B12測定用培養(yǎng)基本底對線性的直接影響

通過系統(tǒng)的對比實驗，揭示了不同品牌的維生素B12測定用培養(yǎng)基對標(biāo)準(zhǔn)曲線線性的顯著影響。使用本底較高的維生素B12測定用培養(yǎng)基時，即使將培養(yǎng)基稀釋一倍使用，接種空白管依然有明顯生長。這導(dǎo)致低濃度點的響應(yīng)被“抬高”，而高濃度點的相對生長優(yōu)勢減弱，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性不佳，R2值僅為0.96左右，且常需要剔除高濃度點才能勉強(qiáng)成線^[1]。

相比之下，使用幾乎不含本底的維生素B12測定用培養(yǎng)基時，接種空白管幾乎無生長，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈現(xiàn)出良好的梯度正生長，R2值可達(dá)0.995以上。實驗進(jìn)一步證實，當(dāng)維生素B12測定用培養(yǎng)基不含本底時，菌懸液濃度和培養(yǎng)時間的微小變化只會影響整體吸光度值的大小，而不會破壞曲線的線性關(guān)系^[1]。通過結(jié)果得出結(jié)論，維生素B12測定用培養(yǎng)基的本底是標(biāo)準(zhǔn)曲線失敗或線性不良的首要原因。只有選擇低本底甚至零本底的培養(yǎng)基，才能獲得理想的線性結(jié)果。

操作中的關(guān)鍵控制點

即便選用了優(yōu)質(zhì)的維生素B12測定用培養(yǎng)基，微生物法本身操作環(huán)節(jié)多，仍需嚴(yán)格控制。試管和移液管必須用20%鹽酸浸泡，再以蒸餾水沖洗干凈，并在200℃下干熱滅菌2-3小時。任何洗滌劑或油漬殘留都會異常促進(jìn)菌株生長，破壞實驗梯度^[2]。接種前，菌懸液的透光率應(yīng)控制在60%-80%（通常以75%為宜）。菌液過濃會導(dǎo)致所有試管生長過盛，梯度不明顯；菌液過稀則生長不足，延長培養(yǎng)時間^[2]。每次測定樣品時，必須同步使用相同批次的維生素B12測定用培養(yǎng)基制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，并包含質(zhì)控樣，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。

法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)與菌株

在我國，使用維生素B12測定用培養(yǎng)基方法依據(jù)GB 5009.285-2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B12的測定》。標(biāo)準(zhǔn)方法中通用的測試菌株為萊士曼氏乳桿菌 Lactobacillus leichmannii，推薦使用菌株編號ATCC 7830。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳緒華， 劉健， 江一飛. 不同測定培養(yǎng)基對維生素B12線性的影響[J]. 生物技術(shù)世界， 2013(4): 47,131.

[2] 魯盛靜， 田野. 嬰幼兒食品和乳制品中維生素B12測定的探討[J]. 中國乳品工業(yè)， 2013, 41(2): 50-52, 55.