簡介

人正常肝細(xì)胞WRL68是常用永生化正常肝細(xì)胞株，保留肝細(xì)胞葡萄糖代謝等生理功能，適用于氧化應(yīng)激、胰島素抵抗相關(guān)體外研究。通常選用3-5代穩(wěn)定細(xì)胞開展實驗。經(jīng)H?O?氧化損傷后，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA升高，伴隨凋亡相關(guān)Annexin-V表達(dá)上調(diào)，增殖與葡萄糖利用能力下降,高濃度過氧化氫長期刺激會引發(fā)細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞崩解，糖代謝紊亂進(jìn)一步加重。

人正常肝細(xì)胞WRL68的形態(tài)

培養(yǎng)方法

人正常肝細(xì)胞WRL68的復(fù)蘇：從液氮罐中取出保存的凍存管，迅速投入37℃溫水中，輕輕搖動使內(nèi)容物盡快融化。用酒精消毒后開啟并用吸管吸出細(xì)胞懸液，加入預(yù)先加有6ml完全培養(yǎng)液的離心管，混合后800rpm/min離心5min，除去上清液。用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種培養(yǎng)瓶，并放入CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。如果復(fù)蘇時人正常肝細(xì)胞WRL68密度較高要及時傳代，細(xì)胞復(fù)蘇時細(xì)胞數(shù)可以做10-20倍稀釋，接種密度以5×10?個細(xì)胞/ml為宜。

人正常肝細(xì)胞WRL68的培養(yǎng)：①培養(yǎng)瓶中的人正常肝細(xì)胞WRL68覆蓋率達(dá)到80%-90%時進(jìn)行傳代。②吸棄原有培養(yǎng)基，加入2ml的PBS清洗細(xì)胞后棄掉。③加適當(dāng)?shù)囊鹊鞍酌福芨采w細(xì)胞就行），消化1-2分鐘。④細(xì)胞都變圓后吸出胰酶終止消化。⑤加入3ml的完全培養(yǎng)基，移液槍吹打細(xì)胞，把細(xì)胞都懸浮起來。⑥把細(xì)胞傳到3個相同規(guī)格的培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO?培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。⑦以生長穩(wěn)定的3-5代人正常肝細(xì)胞WRL68制備細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×10?個，用于實驗[1]。

H?O?氧化損傷對人正常肝細(xì)胞WRL68糖代謝及凋亡的影響

實驗觀察到，人正常肝細(xì)胞WRL68培養(yǎng)24h，其培養(yǎng)基中殘余葡萄糖含量較0h時明顯減少，即葡萄糖被充分利用、供能，維持代謝的需要。而當(dāng)其遭受低濃度的H?O?損傷后，隨著MDA含量逐步上升、Annexin-V表達(dá)逐步增強，而細(xì)胞的增殖率、培養(yǎng)基中葡萄糖含量則呈逐漸下降趨勢，明顯低于同期未受H?O?損傷組。分析其原因很可能是因為H?O?的膜損傷作用使脂質(zhì)過氧化自由基、MDA生成，細(xì)胞Ga2?超載，細(xì)胞膜出現(xiàn)Annexin-V高表達(dá)、磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，使細(xì)胞功能及細(xì)胞膜受體功能受損，代謝功能障礙，葡萄糖不能得以很好的消化利用，出現(xiàn)殘余培養(yǎng)基中葡萄糖含量高于正常組這一胰島素抵抗現(xiàn)象。而在高濃度H?O?組，12h時MDA含量、Annexin-V表達(dá)均陡然升高，細(xì)胞增殖率明顯下降，葡萄糖含量亦高于低濃度組，反映WRL68細(xì)胞此時已遭受嚴(yán)重的損傷，而至24hMDA含量、Annexin-V表達(dá)不升反降，WRL68細(xì)胞增殖率更加下降，葡萄糖含量較低濃度組更高，很可能與此時長期持續(xù)的較高濃度的過氧化損傷導(dǎo)致部分細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞崩解、細(xì)胞膜上各種生化反應(yīng)不能進(jìn)行，此時葡萄糖的消化利用障礙、胰島素抵抗現(xiàn)象更為嚴(yán)重所致[1]。

參考文獻(xiàn)

[1] 徐建華. 人正常肝細(xì)胞過氧化損傷時受體及受體后水平胰島素抵抗現(xiàn)象[D]. 南方醫(yī)科大學(xué), 2014.a