背景^[1-3]

人正常肝細(xì)胞是一株正常肝細(xì)胞系，具有典型的肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，可用于多種實(shí)驗(yàn)研究。

肝細(xì)胞呈多面體形；核大而圓,居中,常染色質(zhì)豐富,部分有雙核或多倍體核；胞質(zhì)嗜酸性,含彌散分布的嗜堿性團(tuán)塊EM（電鏡）：（1）有三種功能面→血竇面→膽小管面→細(xì)胞連接面：有緊密連接、橋粒、縫隙連接(2)細(xì)胞器發(fā)達(dá)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng):合成白蛋白、纖維蛋白原、凝血酶原、脂蛋白和補(bǔ)體等血漿蛋白；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)：參與生物轉(zhuǎn)化和代謝，如膽汁合成、脂類(lèi)代謝、糖代謝、激素代謝和有機(jī)異物的轉(zhuǎn)化；高爾基復(fù)合體：參與蛋白的加工和膽汁排泌線粒體、溶酶體和過(guò)氧化物酶體豐富(3)含糖原、脂滴、色素等內(nèi)涵物肝細(xì)胞核肝細(xì)胞核主要由去氧核糖核酸(DNA)和組蛋白等組成。

人正常肝細(xì)胞

去氧核糖核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，它有復(fù)制遺傳信息的功能?；几窝讜r(shí)，肝炎病毒侵入肝細(xì)胞核內(nèi)，病毒基因可能與肝細(xì)胞核中去氧核糖核酸相結(jié)合(整合)。一旦整合，HBsAg即難以清除，致使HBsAg長(zhǎng)期攜帶。此外，去氧核糖核酸還可能以自己為模板合成信使核糖核酸(mRNA)，從而控制細(xì)胞質(zhì)中各種相應(yīng)蛋白質(zhì)的合成。肝細(xì)胞核如果明顯受損，就意味著整個(gè)肝細(xì)胞崩解毀滅。

線粒體肝細(xì)胞的線粒體很多，每個(gè)細(xì)胞大約有1000個(gè)左右，遍布于胞質(zhì)內(nèi)。肝小葉不同部位肝細(xì)胞內(nèi)線粒體的大小和形態(tài)不完全一致，在正常生理?xiàng)l件下，多為圓形和卵圓形，直徑0.4-0.8μm。線粒體的共同基本形態(tài)結(jié)構(gòu)特征是外被雙層界膜--外界膜和內(nèi)界膜，內(nèi)界膜向線粒體內(nèi)部伸展轉(zhuǎn)折，形成許多嵴。內(nèi)界膜將線粒體分隔為內(nèi)、外兩室，外室介于內(nèi)、外界膜之間，內(nèi)室則圍于內(nèi)界膜之間，其中充滿基質(zhì)。

處理方法：

1.37°C水浴預(yù)熱培養(yǎng)基；

2.從液氮中取出細(xì)胞迅速放入37°C水浴快速解凍（解凍后不要繼續(xù)暖細(xì)胞）；

3.在超凈臺(tái)中加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，1000rpm離心5min；

4.棄上清，加入5ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)入T25培養(yǎng)瓶中，輕輕晃勻；

5.置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)瓶蓋沒(méi)有透氣孔的話,瓶蓋不要擰太緊)；

6.第二天，用新鮮的培養(yǎng)基給細(xì)胞換液后繼續(xù)培養(yǎng)。

應(yīng)用^[4][5]

用于基于脂質(zhì)組學(xué)研究反式脂肪酸對(duì)人正常肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響研究

以人正常肝細(xì)胞LO2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,選擇9t16:1和11t18:1代表R-TFA,9t18:1代表I-TFA,此外,依據(jù)健康人血液（HHB）、心血管疾病人血液（CHB）、牛奶（CM）以及氫化大豆油（HSO）中TFA的比例分別配置了4種反式脂肪酸混合物（TFA-mixture）,將它們作用于LO2細(xì)胞,觀察TFA對(duì)LO2細(xì)胞功能的影響;基于脂質(zhì)組學(xué)技術(shù),考察TFA對(duì)LO2細(xì)胞脂質(zhì)輪廓的影響,通過(guò)偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和t-檢驗(yàn)（student’s t test）找出差異代謝物從而找到差異代謝通路,并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證,揭示不同來(lái)源TFA對(duì)LO2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響并闡明機(jī)理。

結(jié)果如下:1、通過(guò)測(cè)定細(xì)胞存活率、細(xì)胞膜完整性、細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）相對(duì)含量、細(xì)胞內(nèi)甘油三酯（TAG）含量以及細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）含量變化,發(fā)現(xiàn)TFA和TFA-mixture對(duì)LO2細(xì)胞都有一定的損傷作用,都會(huì)降低細(xì)胞的活力和細(xì)胞膜的完整性,提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平,造成細(xì)胞內(nèi)TAG和TC的增加。并且,代表I-TFA的9t18:1對(duì)LO2細(xì)胞功能的損傷作用要明顯高于代表R-TFA的9t16:1和11t18:1（p<0.05）;而CHB和HSO對(duì)肝細(xì)胞損傷作用也顯著性強(qiáng)于HHB和CM（p<0.05）。通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸組成和含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn),LO2細(xì)胞對(duì)9t18:1、9t16:1和11t18:1的吸收率各不相同,其中對(duì)9t18:1的吸收率是最高的。此外,11t18:1在LO2細(xì)胞中會(huì)發(fā)生β氧化反應(yīng)和△9去飽和反應(yīng),分別轉(zhuǎn)化為9t16:1和9c11t-CLA;9t16:1也會(huì)在LO2細(xì)胞中發(fā)生△9去飽和反應(yīng),先轉(zhuǎn)化為11t18:1,然后進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為9c11t-CLA;而9t18:1不發(fā)生這些反應(yīng)。所以推測(cè),不同來(lái)源的TFA之間功能有差異可能是由于它們?cè)诩?xì)胞中有不同的吸收率和不同的生物轉(zhuǎn)化作用。

2、基于脂質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果,發(fā)現(xiàn)不同來(lái)源的TFA及其混合物在100μM的濃度下作用于LO2細(xì)胞24h后,細(xì)胞內(nèi)各種脂質(zhì)的含量發(fā)生顯著變化,其中,TAG、磷脂（PL）和氧化脂質(zhì)（OL）含量顯著升高。多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明9t18:1組和11t18:1組之間貢獻(xiàn)的差異代謝物是TAG（16:0/18:2/18:3）、TAG（16:1/18:1/16:2）和PI（16:2/18:2）;9t18:1組和9t16:1組之間貢獻(xiàn)的是PMeOH（14:1/16:1）、PE（16:1/18:2）和TAG（18:1/18:1/22:5）;11t18:1組和9t16:1組之間貢獻(xiàn)的是TAG（18:1/18:1/22:5）、PI（16:1/18:2）、TAG（18:1/18:2/22:5）和TAG（18:1/18:1/22:6）;CHB組和HHB組之間貢獻(xiàn)的是RvD1、C20:4和RvE1;HSO組和CM組之間貢獻(xiàn)的是12-HEPE、14-HDHA和PGF2α。此外,它們之間的差異代謝通路都涉及到了花生四烯酸（AA）代謝。由于AA代謝通路的多種下游產(chǎn)物與AS的發(fā)生密切相關(guān),其代謝途徑中許多分子和受體可作為AS相關(guān)疾病治療的藥物靶點(diǎn),而AS又是CVD最主要的病因,所以本研究后續(xù)選取AA代謝通路來(lái)進(jìn)一步研究TFA對(duì)LO2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響。

3、通過(guò)western-blot測(cè)定TFA和TFA-mixture對(duì)LO2細(xì)胞磷脂酶A2的影響并探討了磷脂酶A2（PLA2）與AA代謝通路之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,TFA（9t18:1、11t18:1和9t16:1）及其它們的不同比例混合物（HHB、CHB、HSO和CM）均能在一定程度上使得LO2細(xì)胞中PLA2（sPLA2、cPLA2和iPLA2）的蛋白表達(dá)量增加。此外,TFA還可以激活LO2細(xì)胞中AA代謝通路（COX-2、LOX和CYP450）,并且PLA2可以在一定程度上調(diào)控TFA誘導(dǎo)下LO2細(xì)胞內(nèi)的AA代謝通路。然而,盡管不同來(lái)源的TFA都可以激活PLA2-AA代謝通路,但是在這個(gè)過(guò)程中,不同分型的PLA2的特異性并不完全一致。

參考文獻(xiàn)

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