介紹
4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脫氧-B-D-吡喃葡糖霉（常簡稱 GlcNAc-ONP）是一類對硝基苯酚衍生的 N - 乙酰氨基葡萄糖苷，本身是 β-N - 乙酰己糖胺酶的經(jīng)典顯色底物；對其糖環(huán) 6 位羥基進(jìn)行硫酸酯化修飾后，可構(gòu)建出用于黏蛋白脫硫酶活性定量檢測的模型底物。分子由N-乙酰 -β-D-氨基葡萄糖與對硝基苯酚通過 β- 糖苷鍵連接而成，糖環(huán) 2 位為乙酰胺基取代，1 位的對硝基苯基是特征顯色基團(tuán)。
圖一 4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脫氧-B-D-吡喃葡糖霉
硫酸化顯色底物的合成
以4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脫氧-B-D-吡喃葡糖霉為核心起始原料，開發(fā)了單糖與二糖兩類硫酸化顯色底物的合成路線，其中二糖底物的合成路線經(jīng)過優(yōu)化大幅提升了制備效率。
單糖硫酸化底物
4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脫氧-B-D-吡喃葡糖霉是檢測MdsA脫硫酶的核心單糖底物。其合成以3,4-二-O-乙?；Ｗo(hù)的 GlcNAc-ONP 為起始原料，在干燥 N,N - 二甲基甲酰胺中以三氧化硫?吡啶復(fù)合物為硫酸化試劑，室溫下實(shí)現(xiàn) 6 位伯羥基的選擇性硫酸酯化；隨后經(jīng)甲醇鈉介導(dǎo)的脫乙?；磻?yīng)脫除保護(hù)基，再通過陽離子交換樹脂將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為鈉鹽形式，最終經(jīng)色譜純化得到目標(biāo)產(chǎn)物，總收率可達(dá) 72%。
二糖硫酸化底物的合成優(yōu)化
為探究脫硫酶的內(nèi)切/外切屬性，進(jìn)一步合成了模擬黏蛋白內(nèi)部糖鏈結(jié)構(gòu)的二糖硫酸化底物：4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脫氧-B-D-吡喃葡糖6-硫酸鈉。開發(fā)了 6 步短路線：以4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脫氧-B-D-吡喃葡糖霉為起始原料，先對 6 位羥基進(jìn)行叔丁基二苯基硅基（TBDPS）選擇性保護(hù)，再以四 - O - 乙?；肴樘侨纫阴啺孵楣w，三氟化硼乙醚為催化劑，實(shí)現(xiàn) β-(1→4) 糖苷鍵的立體選擇性構(gòu)建；隨后依次脫除硅基保護(hù)基、進(jìn)行 6 位硫酸化、脫除乙?；Ｗo(hù)，最終得到目標(biāo)二糖底物，總收率提升至 26.4%。合成過程中還發(fā)現(xiàn)了特殊的副反應(yīng)規(guī)律：當(dāng)糖環(huán) 3 位為酯基保護(hù)時(shí)，糖基化反應(yīng)會(huì)優(yōu)先發(fā)生在乙酰胺基的烯醇氧上，而非預(yù)期的 4 位羥基。
檢測原理
檢測體系包含硫酸化顯色底物、MdsA 脫硫酶與 β-N - 乙酰己糖胺酶輔助酶：若底物可被 MdsA 脫硫，會(huì)生成普通的4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脫氧-B-D-吡喃葡糖霉，隨后被輔助糖苷酶切割，釋放對硝基苯酚產(chǎn)生顯色信號(hào)；若底物無法被脫硫，則糖苷鍵不能被糖苷酶識(shí)別，體系無顯色反應(yīng)。通過測定 410 nm 處吸光度的變化，即可定量計(jì)算脫硫酶的比活性。單糖硫酸化底物可被 MdsA 高效脫硫，加入輔助酶后產(chǎn)生明顯顯色信號(hào)，測得 MdsA 的比活性為 358 nmol?min?1?mg?1 蛋白；二糖硫酸化底物與 MdsA 孵育后，即使提高糖苷酶濃度與延長反應(yīng)時(shí)間，也無法檢測到顯色信號(hào)，證明 MdsA 無法作用于 4 位被半乳糖取代的內(nèi)部 GlcNAc 硫酸酯。這一結(jié)果明確了 MdsA 是外切型硫酸酯酶，僅能作用于糖鏈末端的 6 位硫酸化 N - 乙酰葡萄糖胺殘基，無法降解黏蛋白糖鏈內(nèi)部的硫酸化單元。
同類底物的拓展體系
還以4-硝基苯基-2-乙酰胺基-2-脫氧-B-D-吡喃葡糖霉合成了半乳糖衍生的兩類硫酸化顯色底物：4 - 硝基苯基 β-D - 半乳糖吡喃糖苷 3 - 硫酸三乙銨鹽與 6 - 硫酸三乙銨鹽，用于檢測脆弱擬桿菌的半乳糖特異性脫硫酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，脆弱擬桿菌中存在至少 4 種脫硫酶同工酶，包括 2 種半乳糖 - 3 - 硫酸酯酶與 2 種半乳糖 - 6 - 硫酸酯酶，各自具有嚴(yán)格的位點(diǎn)特異性。這一結(jié)果印證了腸道黏蛋白降解過程中，微生物會(huì)通過表達(dá)多種位點(diǎn)特異性脫硫酶，協(xié)同完成復(fù)雜硫酸化糖鏈的降解[1]。
圖二 由MdsA硫酸酯酶催化的反應(yīng)體系
參考文獻(xiàn)
[1]Clinch K ,Evans B G ,Furneaux H R , et al.Synthesis and utility of sulfated chromogenic carbohydrate model substrates for measuring activities of mucin-desulfating enzymes[J].Carbohydrate Research,2002,337(12):1095-1111.DOI:10.1016/S0008-6215(02)00104-0.