背景及概述^[1]

肌酸酶(creatinase；EC 3.5.3.3；CRE)屬于水解酶類，催化肌酸水解產(chǎn)生尿素和肌氨酸，是肌酐代謝中的關鍵酶。目前在多種細菌中均發(fā)現(xiàn)肌酸酶的存在，除了極少數(shù)來源的肌酸酶以單亞基的形式存在，大多數(shù)肌酸酶都是同源二聚體，其中對Pseudomonasputida來源的肌酸酶研究最多。

提高穩(wěn)定性的方法^[1-2]

報道一、

阮潔等人為提高肌酸酶（Creatinase,EC 3.5.3.3,CRE）的熱穩(wěn)定性,通過序列比對的方法確定了Arthrobacter nicotianae 23710 CRE熱穩(wěn)定性相關位點K195,并對其進行飽和突變。與野生酶相比,突變體K195V、K195T、K195C和K195L在50℃下的半衰期分別提高260%、 230%、60%和20%;其中,K195V和K195C比酶活分別提高80.7%和88.2%,其他突變體比酶活無明顯變化;突變體K195V、K195T、K195C和K195L的催化效率(kcat/Km)分別提高131%、 218%、 83%和100%。結構分析發(fā)現(xiàn),突變體K195V、 K195T、 K195L較野生酶分別增加了7、12和13個氫鍵。結果表明:對Lys195的突變可有效改變CRE的熱穩(wěn)定性及催化效率,且分子內(nèi)部氫鍵的增加可能是CRE熱穩(wěn)定性提高的重要原因之一。

報道二、

CN201710376236.9提供一種提高肌酸酶pH穩(wěn)定性的方法，所述方法是利用多聚賴氨酸對同源二聚體肌酸酶(NCBI上GenBank：CAA00921.1)進行化學修飾。采用本發(fā)明的方法，經(jīng)多聚賴氨酸修飾后，在肌酸酶表面形成“分子捆綁”作用，在一定程度上增強亞基間相互作用，有效防止了肌酸酶亞基在酸堿性條件下的解聚，有效減少酶失活；肌酸酶經(jīng)修飾后，表面氨基增多，也會對外界酸堿環(huán)境的變化有一定的緩沖作用。采用本發(fā)明的方法制備得到的肌酸酶，pH穩(wěn)定性由6-8提高至4-10，pH穩(wěn)定性提高，而kcat/Km僅僅降低24％。此方法條件溫和，操作簡單，更加適合工業(yè)化應用，為肌酸酶在醫(yī)療診斷等領域的應用提供了方便。而且本發(fā)明的方法也為其他多亞基酶的穩(wěn)定性改造提供了一條可行的途徑。

步驟1、肌酸酶分子表面酸性氨基酸分析

多聚賴氨酸的共價修飾取決于酶表面的酸性氨基酸的個數(shù)，根據(jù)肌酸酶的氨基酸序列及結構(PDB ID:1CHM)分析，Pseudomonasputida來源肌酸酶含有108個酸性氨基酸，其中 76個酸性氨基酸位于酶分子的表面，且側鏈官能團暴露于酶表面，可以參與酶分子表面poly-lysine的修飾。

步驟2：多聚賴氨酸修飾肌酸酶

肌酸酶表面羧基與poly-lysine氨基摩爾比分別為1:20、1:50、1:100、1:150和1:200，CRE-COOH與EDC的摩爾比為1:10、反應pH為7.0，4℃緩慢轉(zhuǎn)動混勻過夜，計算相對酶活力；將不同的摩爾比例獲得的修飾酶超濾除去未結合的小分子修飾劑，置于不同pH值的緩沖溶液(pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)中，25℃放置16h，測定酶活力，以游離酶或修飾酶最適pH條件下的酶活力為100％計算相對活性，確定酶的pH穩(wěn)定性。結果如表1所示。表1不同肌酸酶表面羧基與多聚賴氨酸氨基比例修飾酶的pH穩(wěn)定性

參考文獻

[1] [中國發(fā)明,中國發(fā)明授權] CN201710376236.9 一種提高肌酸酶pH穩(wěn)定性的方法

[2]阮潔,劉松,李江華,堵國成,陳堅.飽和突變提高肌酸酶熱穩(wěn)定性[J].食品與生物技術學報,2019,38(10):8-14.