背景技術(shù)

腫瘤疾病已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的主要敵人之一，其發(fā)病率和死亡率都在逐年上升。死亡率僅次于心血管病，是人類的第二大殺手。如何通過有效措施防治惡性腫瘤已成為我國以至全世界防治疾病的首要任務(wù)，也是全社會(huì)特別是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域急待解決的重大課題。但由于癌癥早期診斷的困難，相當(dāng)數(shù)量的癌癥患者將依賴藥物治療，因此，抗腫瘤藥物的研發(fā)與應(yīng)用是生物醫(yī)藥科學(xué)迅速發(fā)展的一個(gè)重要領(lǐng)域。

宮頸癌是最常見的婦性生殖道惡性腫瘤之一，在我國宮頸癌的發(fā)生占女性生殖道惡性腫瘤的位。不但在女性生殖器官癌瘤中占首位而且是女性各種惡性腫瘤中最多見的癌瘤。卵巢癌是一類很難被早期發(fā)現(xiàn)的癌癥，是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，占婦科癌腫的4%以上，其死亡率居?jì)D科腫瘤首位，發(fā)病率占第三位，次于宮頸癌和宮體癌。卵巢癌的發(fā)病率近年來不斷上升，對女性健康危害極大。近三十年來，婦科癌瘤的治療取得了長足的進(jìn)展，但唯獨(dú)卵巢癌的療效尚無明顯改善。胰腺癌是一種惡性程度很高的消化道常見腫瘤，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，在惡性腫瘤中胰腺癌的發(fā)病率和死亡率都較高。胰腺癌具有高度惡性的生物學(xué)行為，臨床經(jīng)過兇險(xiǎn)，5年生存率很低，在60余種惡性腫瘤中，預(yù)后最差。

中醫(yī)藥治療腫瘤與西醫(yī)治療腫瘤相比有其獨(dú)特的優(yōu)勢，中醫(yī)藥在腫瘤診治上有十分豐富的理論和臨床經(jīng)驗(yàn)。中藥由于成分復(fù)雜，通過發(fā)揮多層次、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的綜合作用而抗腫瘤。中醫(yī)在治療腫瘤思路上充分利用中藥多靶點(diǎn)作用并結(jié)合中醫(yī)理論從整體觀出發(fā)對機(jī)體進(jìn)行整體調(diào)節(jié)。中藥有著良好的研究開發(fā)前景，從中草藥中尋找抗腫瘤有效成分治療惡性腫瘤目前已越來越被廣大學(xué)者與患者所接受，并己成為常用的治療方法，是惡性腫瘤綜合治療中的有效手段之一。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是公開一種紫草提取物的制備方法及其在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明一種紫草提取物的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:

一、制備紫草粉末:將紫草置于溫度為40°C~50°C的條件下烘干，得到干燥的紫草，然后粉碎成粉末，過I號篩，保留篩下，得到紫草粉末；

二、利用CO2超臨界萃取技術(shù)對步驟一得到的紫草粉末進(jìn)行以萘醌類成分為主的有效部位的提取:將步驟一得到的紫草粉末裝入萃取釜中，將萃取釜加熱至40°C~50°C、解析釜加熱至40°C~50°C、貯罐加熱至30°C~40°C，然后開啟CO2瓶，控制CO2流量為20L/h~30L/h，通過高壓泵對系統(tǒng)進(jìn)行加壓，當(dāng)萃取釜的萃取壓力為15MPa~20MPa、解析釜的解析壓力為4MPa~SMPa時(shí)，開始循環(huán)萃取，并保持萃取釜恒溫恒壓，當(dāng)萃取2h~3h后，從解析釜出料口出料，即得到深紅色的濃膏狀紫草提取物。[0009] 本發(fā)明一種紫草提取物的應(yīng)用，是紫草提取物在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):

一、本發(fā)明提供了一種紫草提取物的制備方法，以紫草為原料，利用二氧化碳超臨界萃取技術(shù)對其進(jìn)行以萘醌類成分為主的有效部位的進(jìn)行高效的富集，提取、純化工藝，超臨界流體萃取法與傳統(tǒng)的化學(xué)溶劑提取法相比，其優(yōu)越性是無化學(xué)溶劑殘留，無污染，避免提取物高溫?zé)崃呀?，保護(hù)生理活性物質(zhì)的活性且工藝簡單，提取效率高且純度高，有利于工業(yè)生產(chǎn)；

二、本發(fā)明采用四因素一三水平正交設(shè)計(jì)，以含量和提取量為指標(biāo)，用CO2超臨界流體萃取技術(shù)對中藥紫草中的萘醌類成分的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇，得出紫草中萘醌類成分的萃取條件為:萃取壓力17MPa、萃取溫度40°C、解析壓力5MPa、解析溫度40°C、流量25L/h ;經(jīng)過分光光度法以紫草素測定提取物中總萘醌類成分含量的方法學(xué)考察表明，其精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和加樣回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，說明此方法準(zhǔn)確、可靠；應(yīng)用已建立的HPLC含量測定方法對有效部位群中乙酰紫草素等4種主成分進(jìn)行測定，經(jīng)計(jì)算，四種成分的總含量為58.42 + 6.15%，占總萘醌含量的87.30 + 3.22% ；

三、本發(fā)明通過體外活性篩選實(shí)驗(yàn)來證實(shí)其抗腫瘤活性作用，研究結(jié)果表明，紫草有效部位可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡；紫草有效部位可抑制人子宮頸鱗癌細(xì)胞Siha、人卵巢癌細(xì)胞Skov3、人胰腺癌細(xì)胞Bxpc3、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人卵巢癌細(xì)胞Ηο_8910、人肝癌細(xì)胞H印G2的細(xì)胞生長，并呈劑量和時(shí)間依賴性，表明紫草有效部位對多種腫瘤均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，48h紫草提取物對六種細(xì)胞的IC50值均小于0.9ug/ml ;藥理研究發(fā)現(xiàn)紫草有效部位具有抗腫瘤作用，證明其對人6種腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制作用，并呈明顯的量效關(guān)系，為探索高效且經(jīng)濟(jì)的天然抗腫瘤藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

四、本發(fā)明著重以婦科腫瘤和消化道細(xì)胞株為研究對象，證實(shí)紫草萘醌類有效部位對腫瘤細(xì)胞系具有確切的抑制 生長誘導(dǎo)凋亡的生物活性，為將硬紫草及其萘醌類有效部位開發(fā)成療效卓越、靶點(diǎn)明確的的抗癌新藥提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為婦科癌和消化道癌癥的臨床治療采用合理的方案提供理論依據(jù)和科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

具體實(shí)施方式

具體實(shí)施方式一:本實(shí)施方式一種紫草提取物的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:

一、制備紫草粉末:將紫草置于溫度為40°C~50°C的條件下烘干，得到干燥的紫草，然后粉碎成粉末，過I號篩(2000±70 ym，10目)，保留篩下，得到紫草粉末；

二、利用CO2超臨界萃取技術(shù)對步驟一得到的紫草粉末進(jìn)行以萘醌類成分為主的有效部位的提取:將步驟一得到的紫草粉末裝入萃取釜中，將萃取釜加熱至40°C~50°C、解析釜加熱至40°C~50°C、貯罐加熱至30°C~40°C，然后開啟CO2瓶，控制CO2流量為20L/h~30L/h，通過高壓泵對系統(tǒng)進(jìn)行加壓，當(dāng)萃取釜的萃取壓力為15MPa~20MPa、解析釜的解析壓力為4MPa~SMPa時(shí)，開始循環(huán)萃取，并保持萃取釜恒溫恒壓，當(dāng)萃取2h~3h后，從解析釜出料口出料，即得到深紅色的濃膏狀紫草提取物。

本實(shí)施方式步驟一中所述的紫草為紫草科植物紫草(Lithospermumerythrorhizon sieb.et Zucc)的干燥根,亦稱硬紫草；紫草中主要成分為萘醌類成分,經(jīng)試驗(yàn)證明紫草中萘醌類成分具有對熱不穩(wěn)定性，紫草素在加熱60°C以上顏色由紅色變成紫黑色，隨溫度升高變化速度加快，薄層色譜法檢查斑點(diǎn)消失，提示紫草色素被破壞。

本實(shí)施方式提供了一種紫草提取物的制備方法，以紫草為原料，利用二氧化碳超臨界萃取技術(shù)對其進(jìn)行以萘醌類成分為主的有效部位的進(jìn)行高效的富集，提取、純化工藝，超臨界流體萃取法與傳統(tǒng)的化學(xué)溶劑提取法相比，其優(yōu)越性是無化學(xué)溶劑殘留，無污染，避免提取物高溫?zé)崃呀猓Ｗo(hù)生理活性物質(zhì)的活性且工藝簡單，提取效率高且純度高，有利于工業(yè)生產(chǎn)。

本實(shí)施方式采用四因素一三水平正交設(shè)計(jì)，以含量和提取量為指標(biāo)，用CO2超臨界流體萃取技術(shù)對中藥紫草中的萘醌類成分的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化選擇，得出紫草中萘醌類成分的萃取條件為:萃取壓力17MPa、萃取溫度40°C、解析壓力5MPa、解析溫度40°C、流量25L/h ;經(jīng)過分光光度法以紫草素測定提取物中總萘醌類成分含量的方法學(xué)考察表明，其精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和加樣回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，說明此方法準(zhǔn)確、可靠；應(yīng)用已建立的HPLC含量測定方法對有效部位群中乙酰紫草素等4種主成分進(jìn)行測定，經(jīng)計(jì)算，四種成分的總含量為58.42 + 6.15%，占總萘醌含量的87.30 + 3.22% ；

本實(shí)施方式通過體外活性篩選實(shí)驗(yàn)來證實(shí)其抗腫瘤活性作用，研究結(jié)果表明，紫草有效部位可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡；紫草有效部位可抑制人子宮頸鱗癌細(xì)胞Siha、人卵巢癌細(xì)胞Skov3、人胰腺癌細(xì)胞Bxpc3、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人卵巢癌細(xì)胞Ho-8910、人肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞生長，并呈劑量和時(shí)間依賴性，表明紫草有效部位對多種腫瘤均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，48h紫草提取物對六種細(xì)胞的IC50值均小于0.9ug/ml ;藥理研究發(fā)現(xiàn)紫草有效部位具有抗腫瘤作用，證明其對人6種腫瘤細(xì)胞的生長均有抑制作用，并呈明顯的量效關(guān)系，為探索高效且經(jīng)濟(jì)的天然抗腫瘤藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)施方式著重以婦科腫瘤和消化道細(xì)胞株為研究對象，證實(shí)紫草萘醌類有效部位對腫瘤細(xì)胞系具有確切的抑制生長誘導(dǎo)凋亡的生物活性，為將硬紫草及其萘醌類有效部位開發(fā)成療效卓越、靶點(diǎn)明確的的抗癌新藥提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為婦科癌和消化道癌癥的臨床治療采用合理的方案提供理論依據(jù)和科學(xué)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。