背景[1-3]
人食管鱗癌細(xì)胞從一位49歲，已經(jīng)接受過放療的日本女性患者的頸部食管中分離建立的低分化食管鱗癌。癌組織已侵襲至相鄰組織。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞攜帶有增多的癌基因C-ERB-B(8倍)和CYCLIN D1(4倍)并且細(xì)胞在裸鼠中能夠成瘤。
人食管鱗癌細(xì)胞系集落不規(guī)則沒有顯著角質(zhì)化的侵染性鱗狀細(xì)胞癌。單層培養(yǎng)的細(xì)胞間可以觀察到帶狀連接，也注意到有細(xì)胞質(zhì)張力絲。1970年發(fā)現(xiàn)支原體污染并去除。腫瘤壞死因子（TNF）α抑制ME-180的生長(zhǎng)。這株細(xì)胞含有人乳頭瘤病毒（HPV）DNA，與HPV-39的同源性高于HPV-18。
人食管鱗癌細(xì)胞
人食管鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)操作：
1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
應(yīng)用[4][5]
人食管鱗癌細(xì)胞可以用于ZNF382抑制人食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的功能與機(jī)制研究
研究ZNF382在人食管鱗癌中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控及抑制人食管鱗癌細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的功能與分子機(jī)制研究。
方法和結(jié)果:實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)15對(duì)人食管鱗癌組織和癌旁組織中ZNF382的差異性表達(dá),結(jié)果顯示ZNF382在人食管鱗癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(p<0.05)。
MSP分別檢測(cè)ZNF382在114例人食管鱗癌組織與3例正常食管上皮組織中的甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)87%的食管鱗癌組織發(fā)生了啟動(dòng)子區(qū)的甲基化,而在正常食管上皮組織中甲基化發(fā)生率只有33%。同時(shí)TCGA在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析183例食管鱗癌患者ZNF382表達(dá)水平差異與食管鱗癌患者5年總生存的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)ZNF382表達(dá)水平較高的患者,其5年總生存期較長(zhǎng)。
進(jìn)而通過一系列生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)分別在食管鱗癌細(xì)胞中外源性過表達(dá)ZNF382及敲低內(nèi)源性ZNF382表達(dá)后,觀察其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖,凋亡以及轉(zhuǎn)移的作用。最后為進(jìn)一步明確ZNF382在食管鱗癌中發(fā)揮細(xì)胞功能的具體分子機(jī)制,送檢了RNA-sequence測(cè)序并結(jié)合GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的CHIP-Seq測(cè)序結(jié)果,聯(lián)合生物信息學(xué)分析,RT-PCR驗(yàn)證,Western blot及雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論,ZNF382作為19q13.12的新抑癌基因通過直接結(jié)合到DVL2和FZD1基因的啟動(dòng)子區(qū)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性從而在人食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌功能。
結(jié)論:ZNF382是位于19q13.12的新抑癌基因,直接結(jié)合到FZD1和DVL2基因的啟動(dòng)子區(qū)抑制Wnt/β-catenin通路活性從而在人食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用。
參考文獻(xiàn)
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