背景^[1-3]

人乳腺癌細(xì)胞是從一名69歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離建立，常用于乳腺癌發(fā)病機(jī)理的研究。

人乳腺癌細(xì)胞

人乳腺癌細(xì)胞屬于貼壁細(xì)胞，顯微鏡下呈現(xiàn)上皮細(xì)胞形態(tài)，且保留了多個(gè)分化乳腺上皮的特性，

包括：1）能通過胞質(zhì)雌激素受體加工雌二醇并能形成隆突結(jié)構(gòu)（domes）；

2）能表達(dá)WNT7B癌基因；

3）腫瘤壞死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7細(xì)胞生長；

4）細(xì)胞經(jīng)抗雌激素處理能調(diào)節(jié)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP）的分泌。

人乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

1）復(fù)蘇人乳腺癌細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）人乳腺癌細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1、對于貼壁人乳腺癌細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

3、人乳腺癌細(xì)胞凍存：

1、細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3、用適量的凍存液重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；

4、先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃。

應(yīng)用^[4][5]

人乳腺癌細(xì)胞可以用于姜黃素通過自噬-CTSB-炎癥小體信號通路誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）焦亡的研究

姜黃素作為一種降血脂藥物,其潛在的獨(dú)特的抗癌特性一直被廣泛關(guān)注。探討姜黃素對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的影響以及其潛在的體內(nèi)外分子機(jī)制。

方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立乳腺癌動物模型,觀察姜黃素對腫瘤生長的影響,免疫組化法檢測Caspase-1、IL-1β和IL-18的陽性反應(yīng)情況。Western blot法測定腫瘤組織中焦亡相關(guān)蛋白ASC、pro-Caspase-1、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18;NLRP3炎癥小體;組織蛋白酶B;自噬相關(guān)蛋白LC3及p62的表達(dá)水平。

體外實(shí)驗(yàn):MTT法測定姜黃素對細(xì)胞存活率的影響。Western blot法測定焦亡相關(guān)蛋白ASC、pro-Caspase-1、GSDMD、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18;NLRP3炎癥小體;組織蛋白酶B;自噬相關(guān)蛋白LC3及p62的表達(dá)水平。ELISA與LDH法檢測細(xì)胞外的IL-1β、IL-18和LDH的釋放量。免疫熒光法測定胞質(zhì)CTSB的表達(dá)水平以及細(xì)胞溶酶體的破壞情況。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、微血管形成實(shí)驗(yàn)、平板克隆實(shí)驗(yàn)用于測定姜黃素對細(xì)胞功能的影響。

本研究使用NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950、組織蛋白酶B抑制劑CA-074 Me、自噬抑制劑3-MA作用于細(xì)胞,探討NLRP3炎癥小體、組織蛋白酶B和細(xì)胞自噬在姜黃素誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞焦亡中的作用。

結(jié)果:姜黃素能夠顯著降低MCF-7乳腺癌細(xì)胞存活率。MTT法篩選出藥物處理?xiàng)l件為姜黃素8μM處理48小時(shí)。姜黃素能夠在體內(nèi)外誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞發(fā)生焦亡:姜黃素處理組小鼠腫瘤組織切片焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1、IL-1β和IL-18免疫組化陽性反應(yīng)顯著。

姜黃素處理組相比于對照組LC3、CTSB、ASC、proCaspase-1、GSDMD、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平顯著升高,p62蛋白表達(dá)水平顯著降低;姜黃素處理組的IL-1β和IL-18以及LDH釋放量相比于對照組顯著升高;姜黃素處理組相比于對照組能夠顯著降低MCF-7乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞遷移、微血管形成和平板克隆能力。

姜黃素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞焦亡是基于NLRP3炎癥小體的激活:經(jīng)MCC950預(yù)處理4小時(shí)后,對照組NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平、IL-1β和IL-18以及LDH釋放量相比于姜黃素處理組顯著降低。細(xì)胞遷移、微血管形成和平板克隆能力相比于姜黃素處理組顯著升高。

姜黃素誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活和細(xì)胞焦亡是由胞質(zhì)CTSB介導(dǎo)的:經(jīng)CA-074 Me預(yù)處理4小時(shí)后,對照組CTSB、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的蛋白表達(dá)水平、胞質(zhì)CTSB水平、IL-1β和IL-18以及LDH的釋放量相比于姜黃素處理組顯著降低;細(xì)胞遷移、微血管形成和平板克隆能力相比于姜黃素處理組顯著升高。

姜黃素使MCF-7細(xì)胞自噬水平上調(diào)并通過自噬誘導(dǎo)CTSB釋放、NLRP3炎癥小體激活和細(xì)胞焦亡:經(jīng)3-MA預(yù)處理4小時(shí)后,對照組LC3、CTSB、NLRP3、Caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)水平、IL-1β和IL-18以及LDH的釋放量相比于姜黃素處理組顯著降低;p62蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞遷移、微血管形成和平板克隆能力相比于姜黃素處理組顯著升高。

結(jié)論:姜黃素能夠誘導(dǎo)MCF-7乳腺癌細(xì)胞自噬進(jìn)一步激活NLRP3炎癥小體,通過自噬/CTSB/NLRP3/Caspase-1/GSDMD信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡,并能夠抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移。

參考文獻(xiàn)

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