背景技術(shù)
麥芽糖酸，作為一種化妝品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛的原料，其相較大部分的化妝品原料具有更為溫和安全的特點。其對皮膚膚質(zhì)的改善，有突出的幫助，具有提亮膚色，豐盈肌膚，淡化細(xì)紋，修復(fù)皮膚屏障，調(diào)整皮膚水油平衡，改善皮膚黃暗無光澤等等諸多功效，故而，其一直有著很高的市場熱度。
關(guān)于麥芽糖酸的制備，在傳統(tǒng)工藝中，通常是通過麥芽糖的酸水解來實現(xiàn)。在酸性條件下進(jìn)行水解反應(yīng)即可得到麥芽糖酸。這種工藝中往往需要用到強(qiáng)腐蝕性、易爆炸的危險化學(xué)品次氯酸作為輔劑，這導(dǎo)致該反應(yīng)有極高的安全風(fēng)險，并且產(chǎn)生較大的環(huán)境污染隱患。為了解決這個問題，在現(xiàn)有的工藝中嘗試使用了生物合成法來生產(chǎn)麥芽糖酸，例如：用假單孢菌進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)麥芽糖酸。然而，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌發(fā)酵法存在產(chǎn)物濃度不高，發(fā)酵效率不穩(wěn)定，產(chǎn)物生物質(zhì)殘留過大等等缺點。
由此，在麥芽糖酸的人工合成領(lǐng)域，如何尋找到一種安全可靠，環(huán)保，且能夠穩(wěn)定生產(chǎn)的麥芽糖酸的制備方法顯得極為迫切。
制備方法[1]
S1.表達(dá)酶基因的大腸桿菌的構(gòu)建：使質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞在冰浴中充分接觸，將上述的細(xì)胞置于40?45℃的水浴鍋中，熱擊60?90s后，冰浴1?5min；將新鮮LB培養(yǎng)基加入到上述的Ep管中，于37℃搖床中復(fù)蘇1?2h；吸取培養(yǎng)基涂布在含有氨芐青霉素的平板上，等待吹干后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)10?14h；
S2.大腸桿菌工程菌發(fā)酵產(chǎn)酶：從平板上挑取單菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基中,于37℃，60?200rpm過夜培養(yǎng)10?14h；按1?5％(v/v)接種量接種至LB液體培養(yǎng)基中,于37℃,60?200rpm中培養(yǎng)至OD600為0.6?0.8；加入誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)后，將搖瓶轉(zhuǎn)移至10?16℃，60?200rpm的搖床中， 誘導(dǎo)表達(dá)16?24h；于1?4℃離心機(jī)中離心收集菌體；
S3.脫氫酶粗酶液的制備：取S2中的菌體沉淀，用緩沖液重懸洗滌,并再次離心收集菌體；使用緩沖液進(jìn)行重懸，超聲處理細(xì)胞,破碎后的液體于1?4℃高速離心10?20min后,取上清即為粗酶溶液。三種粗酶液分別為：SN?WP_229570684.1(SEQ ID NO：1)；SN?MBX8632158.1(SEQ ID NO：2)；SN?WP_110379760.1(SEQ ID NO：3)。
S4.水相體系中5g/L麥芽糖為底物酶法催化合成麥芽糖酸(最佳條件)：5g/L(14.5mM)麥芽糖，10U/ml粗酶液，0.5mM NAD+，輔底物丙酮酸鈉30mM，乳酸脫氫酶(LDH)20U/mL，最后利用0.1mol/L磷酸緩沖液(pH6.8)將反應(yīng)體積補(bǔ)至20ml。混合均勻后置于35℃加熱攪拌器中，200rpm ,攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，取1ml反應(yīng)液，12000rpm離心2min ,取上清液過濾膜后用高效液相色譜檢測底物消耗，HPLC檢測產(chǎn)物麥芽糖酸的生成。得到三種酶的轉(zhuǎn)化率：SN?WP_229570684.1：65％；SN?MBX8632158.1：88％； SN?WP_110379760.1：61％。
參考文獻(xiàn)
[1] 上海克琴科技有限公司. 一種麥芽糖酸的制備方法:CN202411082455.2[P]. 2024-11-05.