軟骨藻酸（DA）是一種天然的海洋植物毒素，也被稱為失憶性貝類毒素（ASP），主要由海洋硅藻擬菱形藻產(chǎn)生，分子式為C15H21NO6，相對分子量為311.33，易溶于水，具有強大的神經(jīng)毒性。擬菱形藻屬是中國沿海水域浮游植物群落的重要組成部分，通常在春季和夏季形成水華，是軟骨藻酸的重要生物來源。過量食用含軟骨藻酸的貝類等海鮮，會導(dǎo)致人類胃腸道紊亂和頭痛、昏迷、平衡失調(diào)、意識混亂、記憶喪失等一系列神經(jīng)精神癥狀。軟骨藻酸可在貝類等水生動物中累積，沿食物鏈傳遞并逐級放大，人類和海洋哺乳類動物會產(chǎn)生不同程度的中毒癥狀，同時，軟骨藻酸大量富集還會引起大量魚類和貝類死亡。
軟骨藻酸與其類似物紅藻氨酸（KA）一樣，是一種興奮性氨基酸，激動大腦背側(cè)海馬區(qū)谷氨酸受體。然而，軟骨藻酸的毒性是紅藻氨酸的3倍。在接觸軟骨藻酸后，它主要與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合，并導(dǎo)致神經(jīng)元去極化。第一起人類DA中毒事件，發(fā)生在1987年加拿大愛德華王子島，由于食用受軟骨藻酸污染的貽貝，導(dǎo)致4人死亡，100多人出現(xiàn)不同程度中毒。為了最大限度減少軟骨藻酸對人和動物造成的影響，加拿大首先將貝類肉中軟骨藻酸的最高限量定為20mg/kg，然后歐洲和日本相繼將這種毒素列為貝類的常規(guī)檢測項目。
檢測方法
由于軟骨藻酸毒性大、反應(yīng)快，中毒后無特異解毒劑，所以開展軟骨藻酸的快速檢測研究對確保水產(chǎn)品安全及人體健康極為重要。目前的方法主要是檢測浮游植物、貝類、海水以及人體和動物的血液、尿液等生物樣本中軟骨藻酸含量。常見的軟骨藻酸檢測方法有小鼠生物（MBA）法、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法以及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法等。除上述檢測技術(shù)外還有毛細管電泳法、生物傳感器法、分子印跡法等也被用于軟骨藻酸的檢測。
1、小鼠生物法
MBA法的原理是將毒素注射入小鼠體內(nèi)，根據(jù)注射后小鼠的存活時間和中毒癥狀來評價毒性，一般用半數(shù)致死劑量（LD50）表示。該方法適于檢測貝類組織中高質(zhì)量濃度的軟骨藻酸(300～1 000μg/g)，軟骨藻酸含量低于20μg/g 的貝類組織無法檢測；該方法應(yīng)用廣泛、能表達出樣品的實際毒性、不需要復(fù)雜貴重的儀器設(shè)備等優(yōu)點，但也存在著較多缺陷，例如僅能測定毒性的大小和有無，無法確定毒素的組成和成分，檢出限低，重復(fù)性差，測試時間長，結(jié)果易受影響等，已逐漸被其他新的分析方法所取代，但在毒理學(xué)領(lǐng)域仍具有重要意義。
2、酶聯(lián)免疫吸附法
ELISA法是利用酶標抗原和抗體特異性結(jié)合的原理來進行檢測和分析，采用特異性貝類毒素的抗體對軟骨藻酸進行檢測，包括多克隆抗體直接競爭、多克隆抗體間接競爭以及單克隆抗體間接競爭方法。該方法靈敏度高，且目前已研制出多種快速檢測軟骨藻酸的ELISA方法及試劑盒。
李柄熹等運用間接競爭ELISA法檢測貝類樣品中軟骨藻酸含量，通過檢測發(fā)現(xiàn)軟骨藻酸的質(zhì)量濃度在5～2500ng/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢出限為5ng/mL，在4種貝類樣品的消化腺和肌肉中均檢測出一定量的軟骨藻酸，樣品總檢出率為100%。
3、高效液相色譜法
HPLC法是利用流動相和固定相對混合物中不同組分親和力的差別達到分離效果的一種定性和定量分析技術(shù)。褚瑩倩等利用超高效液相色譜-紫外檢測法快速測定貝類中軟骨藻酸的殘留量，軟骨藻酸的質(zhì)量濃度在0.1～10.0μg/g 范圍內(nèi)與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，檢出限為0.2μg/g，樣品加標回收率為76.8%～91.2%，測定結(jié)果的相對標準偏差為11%～16%（n=6）。高治昊等應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測器法，檢測貝類樣本中的軟骨藻酸含量，該方法在0.02～1.0ng/mL 質(zhì)量濃度范圍具有良好線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999，樣品平均加標回收率為108%，檢出限為23.5ng/mL，測定結(jié)果的相對標準偏差為3.5%（n=6），適用于對貝類產(chǎn)品中軟骨藻酸的快速檢測。
4、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
HPLC-MS/MS法是目前海洋貝類毒素定量測定方法中靈敏度最高、選擇性最好、應(yīng)用最為廣泛的方法之一，在海產(chǎn)品貝類毒素的測定國際標準以及國家標準中，均是使用該方法。田璐等探究高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定軟骨藻酸含量的方法條件，并進行驗證，軟骨藻酸質(zhì)量濃度在0.5～25.0ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法檢出限為1.5ng/mL，定量限為5ng/mL，平均回收率為68.7%～92.4%，使用此方法在福建省中北部海域養(yǎng)殖貝類中檢測到軟骨藻酸。
5、其它方法
毛細管電泳法是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)，主要根據(jù)各毒素分子所帶電荷量的不同將其進行分離。ZHANG等建立了一種毛細管電泳酶免疫分析-電化學(xué)檢測軟骨藻酸的方法，該方法的線性范圍為0.1～50ng/mL，檢出限為0.02ng/mL，加標回收率為89.6%～105.8%。
生物傳感器是一種分析裝置，由生物識別元件和傳感器組成，可以將生物反應(yīng)產(chǎn)生的信息轉(zhuǎn)化為可定量處理的電信號，以此來檢測物質(zhì)的濃度。YAKES等使用單通道和多通道SPR生物傳感器，用于抗體的選擇和表達，并在貝類組織中檢測到軟骨藻酸。選擇高靈敏度抗體，其半數(shù)抑制濃度（IC50）單克隆抗體為4.8～6.9ng/mL，多克隆抗體為2.3～6.0ng/mL，且可在1min的時間內(nèi)檢測軟骨藻酸。
分子印跡技術(shù)是一種重要的仿生識別工具，可以模擬抗體和酶的特異性識別性能。因此，制備的分子印跡聚合物不僅可以表現(xiàn)出與抗體相當?shù)倪x擇性和特異性，而且可以彌補抗體穩(wěn)定性差、獲取困難、價格昂貴等缺陷。AO等建立了一 種分子印跡聚合物樣品凈化方法，從海水和貝類樣品中富集軟骨藻酸，將分子印跡固相萃取柱用于高效液相色譜-紫外檢測法聯(lián)用進行軟骨藻酸檢測，海水和貝類樣品中DA的檢出限分別為20、50ng/mL。HE等使用虛擬模板分子印跡結(jié)合固相萃取高效液相色譜檢測海水中的軟骨藻酸。
參考文獻
[1] 高鈺杰,游杰,黃海燕. 軟骨藻酸檢測方法研究進展[J]. 化學(xué)分析計量,2024,33(4):126-132. DOI:10.3969/j.issn.1008-6145.2024.04.023.