【背景及概述】[1][2][3]
水蛭是我國傳統(tǒng)中藥中常用的活血化瘀通經(jīng)的良藥，始載于東漢時期的藥物學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》。水蛭素( hirudin) 是存在于水蛭唾液腺里的一種重要活性成分，1884 年 Haycraft 首先發(fā)現(xiàn)醫(yī)用水蛭的提取物中含有抗凝血物質(zhì)，1904 年 Jacoby 將其定名為水蛭素(Hirudin) ，1955年Markwardt 從醫(yī)用水蛭咽周腺體中成功地分離出水蛭素純 品。1986 年Harvey分離出水蛭素編碼純系 cDNA，從此利用基因工程技術(shù)制備重組水蛭素成為現(xiàn)實。它是一種目前已知的高效、特異的、最強的凝血酶抑制劑。
水蛭素是由65～66個氨基酸殘基組成的小分子單鏈環(huán)肽化合物，相對分子質(zhì)量為7000。水蛭素具有抗凝血和抗血栓的作用，其抗凝作用專一且抗凝活性強于肝素，是一種特異性最強的天然凝血酶抑制劑。水蛭素最開始應(yīng)用于一些血栓性疾病，隨著近年來人們對水蛭素研究的不斷進展，其在抗凝、抗栓、抗炎、調(diào)脂、改善循環(huán)等方面的作用機制不斷得到揭示，臨床應(yīng)用得到廣泛擴展但由于受到地理位置、氣候條件等因素的影響，天然水蛭素的產(chǎn)量不足、成本較高，臨床研究及應(yīng)用比較受限。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已制得多種重組水蛭素，克服了天然水蛭素來源困難等問題。
【結(jié)構(gòu)】[1][4]
天然水蛭素是一條含65或66 個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，分子質(zhì)量為 7 kD，其N 末端有3對二硫鍵(Cys6-Cysl4，Cys16-Cys28，Cys32-Cys39)，使肽鏈繞疊成密集形核心環(huán)肽結(jié)構(gòu)，對蛋白結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用。其N 末端含活性中心，能識別底物—凝血酶堿性氨基酸富集位點，并與之結(jié)合。C 末端富含酸性氨基酸殘基，最后9個氨基酸中有6個為酸性氨基酸。天然水蛭素第 63 位的酪氨酸殘基被硫酸化，而重組水蛭素沒有這個特殊的結(jié)構(gòu)，因此后者抗凝比活性有所下降。水蛭素肽鏈中部有一個由 Pro-Lys-Pro 組成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，這有助于維持水蛭素分子的穩(wěn)定性并引導(dǎo)水蛭素分子以正確的方向與凝血酶分子結(jié)合。
【藥理作用】[1] [3]
1. 抗凝
與肝素、枸櫞酸納等其他抗凝血藥物不同，水蛭素抑制凝血酶活性不依賴任何輔助因子，它與凝血酶以非共價鍵的形式形成 1：1 不可逆的復(fù)合物，水蛭素與肝素及肝素-肝素輔因子Ⅱ抑制凝血酶活性的不同之處還在于水蛭素能抑制游離的和血栓中的凝血酶，與凝血酶綁定纖維蛋白裂解產(chǎn)物一樣。另水蛭素與血漿蛋白沒有相互作用，而肝素能結(jié)合血漿蛋白，可以解釋肝素應(yīng)用的局限性，如不能預(yù)測肝素的量效關(guān)系以及肝素效果的抵抗性。水蛭素阻止凝血酶產(chǎn)生的效果沒有肝素強，但在抑制凝血酶激活方面比肝素強。水蛭素引起的出血或血小板減少等副作用明顯少于肝素，正越來越廣泛地被應(yīng)用于治療血栓形成的臨床中。進一步研究發(fā)現(xiàn)水蛭素能通過阻斷自然殺傷細(xì)胞逆轉(zhuǎn)血小板對纖維蛋白素原的作用，從而產(chǎn)生抗凝血作用。水蛭素主要通過抑制凝血酶活性或影響血小板、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞的活性和功能而產(chǎn)生抗凝血作用。
2. 抗血栓
凝血酶誘發(fā)的血液凝固是血管血栓形成的主要觸發(fā)機制，它可使纖維蛋白凝固，激活血小板產(chǎn)生血小板凝聚，進而產(chǎn)生更多的凝血酶。研究發(fā)現(xiàn)水蛭素直接靶向凝血酶，能有效地防止纖維蛋白和血細(xì)胞結(jié)合形成血凝塊，并且抑制游離的和凝血塊上的凝血酶，因此可防止各血栓的形成及延伸。水蛭素能降低凝血過程中血纖維蛋白肽A 的減少，這種作用呈劑量相關(guān)性，反映水蛭素具有抑制凝血酶水解纖維蛋白原形成纖維蛋白的作用。水蛭素和肝素都能加快重組組織纖溶酶原激活物( rt-PA) 溶解富含血小板血栓，但是只有聯(lián)合使用水蛭素能清除血管壁上殘留的血栓。
3. 抗炎
通過觀察水蛭素對大鼠隨意皮瓣成活效果的研究表明，水蛭素與凝血酶以等摩爾比形成非共價鍵緊密結(jié)合的穩(wěn)定復(fù)合物，并使之失活，從而有效地抑制炎癥作用。研究表明水蛭素能夠提高瘀血皮瓣局部超氧化物歧化酶水平、減少瘀血皮瓣局部丙二醛水平，減輕局部炎癥反應(yīng)。
【藥代動力學(xué)】[5]
動物研究表明，大鼠口服熒光標(biāo)記水蛭素(FITC-rHV2)1h后血濃度達峰值，2～3 h逐漸降低,尿濃度大于血濃度。水蛭素口服吸收效果不佳，生物利用度低，氣管內(nèi)灌注僅少許吸收，但皮下注射吸收良好。主要經(jīng)腎排泄。靜脈注射分布半衰期為15～20 min，清除半衰期約為1～2 h。分別皮下注射重組水蛭素CGP39393 0.1、0.2、0.3和0.4 mg/kg，0.5 h后部分凝血酶原活化時間(APTT)延長值達高峰，24 h后基本恢復(fù)。
【臨床應(yīng)用】[1][5]
1. 心腦血管疾病
通過觀察尿激酶聯(lián)合不同抗凝劑治療 ST 段抬高型急性心肌梗死患者心臟超聲指數(shù)，重組水蛭素組射血分?jǐn)?shù)(EF) 、心輸出量(CO) 及心臟指數(shù)(CI)顯著高于低分子肝素組，表明重組水蛭素改善心功能效果更加顯著；通過觀察水蛭素注射液對腦梗死患者運動功能的影響，表明水蛭素可明顯改善腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損評分，促進運動功能恢復(fù)；通過對高血壓腦出血患者術(shù)中局部應(yīng)用水蛭素，表明水蛭素能有效減輕腦水腫，改善患者神經(jīng)功能，且應(yīng)用安全、有效、可靠，不會增加遲發(fā)性出血的風(fēng)險。
2. 急性彌漫性血管內(nèi)凝血( DIC)
24 例男性健康志愿者靜脈注射脂多糖( LPS) 2 mg/kg，誘發(fā) DIC，隨后分為實驗組與對照組進行，治療結(jié)果顯示，對照組凝血酶-抗凝血酶Ⅲ復(fù)合物(TAT) 和 D-D二聚體明顯高于實驗組，提示水蛭素有治療 DIC 功效。
3. 皮膚瘢痕
研究發(fā)現(xiàn)水蛭素可能通過減少膠原產(chǎn)生來抑制增生性瘢痕，而減少膠原產(chǎn)生則是通過直接抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞( HSFb) 的I、III型前膠原 m RNA 的表達來實現(xiàn)的；通過觀察水蛭素對皮膚增生性瘢痕成纖維細(xì)胞 bF-GF 及 TGFp 表達的影響，表明水蛭素可下調(diào) TGFβ1m RNA 和蛋白水平表達，同時上調(diào) b FGF 的 mRNA 和蛋白水平表達，作用呈劑量依賴性，水蛭素對瘢痕有治療效果；通過觀察不同濃度水蛭素對體外培養(yǎng) HSFb 的影響，表明水蛭素對HSFb 的增殖有抑制作用，水蛭素能增加 Bax 表達，抑制 Bcl-2表達，實驗濃度水蛭素對 HSFb 有顯著的抑制作用。
4. 腎臟疾病
瘀血、脂質(zhì)代謝紊亂常見于腎臟疾病病人，而水蛭素能夠降低蛋白尿，改善腎功能，降低血脂，具有抗凝、抗血栓形成、改變血液流變性、抗炎、抗增殖和抗纖維化等多種藥理活性。通過觀察水蛭素對 IgA 腎病患者的隨機對照研究，表明水蛭素在降低 IgAN 血尿、蛋白尿和腎臟保護方面比潘生丁更具優(yōu)勢。通過對特發(fā)性膜性腎病治療的回顧性分析， 認(rèn)為水蛭素在降低尿蛋白速率、Ccr 上升速率方面均優(yōu)于潘生丁，血漿黏度、纖維蛋白原、TC、TG 和 LDL 均顯著下降( P<0.01) ，血漿白蛋白顯著升高。糖尿病腎病和高血壓腎病在微量白蛋白尿期，腎損害處于可逆階段，早期治療、延緩其進入顯性蛋白尿期和腎衰竭期，具有重大的臨床意義。研究表明，尿微量白蛋白與血管內(nèi)皮損傷、胰島素抵抗有關(guān)，也是全身血管內(nèi)皮功能受損的一個重要標(biāo)志；通過觀察水蛭素對以尿微量白蛋白為主要表現(xiàn)的糖尿病腎病和高血壓腎病患者的療效，表明水蛭素可降低尿中微量白蛋白、改善高凝狀況，對糖尿病腎病和高血壓腎病患者的腎臟有較好的保護作用。
5. 抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用
水蛭素能抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長和增值。提前給予水蛭素可抑制A549 人非小細(xì)胞肺癌和 MDAMB231 人乳腺癌細(xì)胞在裸鼠植入和生長，但并不抑制腫瘤接種 4~8 d 后的腫瘤植入和生長。水蛭素能延長尾靜脈注射 A549 腫瘤細(xì) 胞 的實驗性肺轉(zhuǎn)移模型小鼠的存活期，抑 制B16F10 黑色素瘤細(xì)胞和 4T1 乳腺癌細(xì)胞在同源基因小鼠上的腫瘤植入和生長，能誘導(dǎo) B16F10 黑色素瘤細(xì)胞和 4T1 乳腺癌細(xì)胞腫瘤結(jié)節(jié)壞死。水蛭素能減少綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的 B16F10 移植腫瘤細(xì)胞進入血液，減少自發(fā)性轉(zhuǎn)移模型肺部結(jié)節(jié)數(shù)。研究者比較了水蛭素治療的 TRAMP 小鼠和 PBS 處理的小鼠，使用 ki-67 染色法監(jiān)測細(xì)胞增值情況，顯示水蛭素抑制 TRAMP 小鼠 （C57BL/6 and C57BL/6FVB）的前列腺癌的生長，腫瘤體積、腫瘤百分比和前列腺腫瘤的重量都分別下降，前列腺癌的發(fā)生率也降低，證明水蛭素對腫瘤浸潤有良好的拮抗作用，對腫瘤有絲分裂也有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素能減少肺癌病人支氣管肺泡灌洗液誘導(dǎo)的 MCF-7、A-431、Sk-Mel-28 等腫瘤細(xì)胞的增值；使用水蛭素治療，最初治療組小鼠肺部腫瘤數(shù)量與對照組是一樣的，但腫瘤細(xì)胞的擴散及隨后的駐留在抗凝小鼠肺部明顯被抑制。因此，水蛭素預(yù)處理后腫瘤細(xì)胞的生長和增值被抑制，已經(jīng)形成的腫瘤使用水蛭素后也能被抑制。
6. 療纖維沉淀性關(guān)節(jié)炎
關(guān)節(jié)纖維蛋白積累可導(dǎo)致膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎， PEG-水蛭素能有效減少CIA的病情嚴(yán)重性和發(fā)生率。組織學(xué)分析表明PEG-水蛭素能有效地減少滑液增生，減少關(guān)節(jié)纖維蛋白沉積，對關(guān)節(jié)炎既有預(yù)防又有治療效果。
7. 減輕腦出血水腫
利用大鼠自體新鮮無肝素未凝動脈血定量腦出血模型，觀察不同時間大鼠腦出血周圍腦組織含水量，離子含量變化，研究水蛭素對水腫程度及離子含量的影響，結(jié)果表明大鼠腦出血后早期腦組織含水量，離子含量隨時間推移而升高、變化，而水蛭素可減輕其水腫程度及離子變化。
8. 抑制增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變
將水蛭素0.1mL(10單位)注入兔玻璃體腔內(nèi)，對照組注入0.1 mL生理鹽水，用放射免疫法測定玻璃體腔內(nèi)層粘連蛋白和IV型膠原的含量，結(jié)果表明外傷后一周水蛭素組比對照組含量明顯下降，水蛭素對外傷性增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變有一定的抑制作用。
10. 治冠狀動脈成形術(shù)后再狹窄
水蛭素在防治冠狀動脈成形術(shù)(PTCA)后再狹窄的發(fā)生有明顯的效果。應(yīng)用重組水蛭素對113例因不穩(wěn)定心絞痛(USA)作PTCA患者進行觀察。水蛭素劑量首次20 mg,以后為每小時0.16 mg /kg維持24 h；并與常規(guī)劑量的肝素組作對照。結(jié)果顯示，術(shù)中及術(shù)后心肌梗塞發(fā)生率，水蛭素組為1.4% ,肝素組為10.3% ；24 h血管完全再通率，水蛭素組為100%，肝素組為91%。且出血不良反應(yīng)水蛭素組僅為3.5%。
此外，水蛭素在防治不穩(wěn)定性心絞痛、急性心肌梗塞，血液透析等方面都有很好的效果。
【提取】
雙水相-反膠束提取法提取水蛭素：
1）將菲牛蛭鮮活個體放入80～90℃的熱水中2～3分鐘，迅速撈出，放冷至室溫，瀝至半干；或?qū)⒂?18℃保存的菲牛蛭個體取出，放至室溫，瀝至半干。
2）取一定量將瀝至半干的菲牛蛭個體于組織搗碎機中以10000～12000r/min處理5～6分鐘搗成漿狀。
3）取一定量漿狀物按重量加入2～2.5倍的生理鹽水240～300r/min攪拌2.5～3小時。
4）4000～4500r/min離心10分鐘取水相，備用，沉淀用組織搗碎機10000～12000r/min處理2～3分鐘搗成漿狀。
5）按步驟3)漿狀物的重量加入1.5～2倍生理鹽水240～300r/min攪拌2～2.5小時。
6）4000～4500r/min離心10分鐘取水相，備用，沉淀用組織搗碎機10000～12000r/min處理2～3分鐘搗成漿狀。
7）按步驟3)漿狀物的重量加入1～1.5倍生理鹽水240～300r/min攪拌2～2.5小時，4000～4500r/min離心10分鐘去沉淀，取水相備用。
8）合并3次的水相，加入硫酸鈉使?jié)舛葹?.05mol·L-1，加聚乙二醇6000使質(zhì)量濃度為30％，240～300r/min攪拌30分鐘。
9）4000～4500r/min離心20分鐘，分離上、下相。
10）取上相水溶液加入2.8～3倍無水乙醇攪拌均勻，冷藏過夜，4000～4500r/min離心10分鐘取沉淀。
11）沉淀溶解于4倍重量的生理鹽水中，用0.05mol·L-1的HCl溶液調(diào)至pH1.8，得酸性水蛭素溶液。
12）正辛烷加入丁二酸-2-乙基己基酯磺酸鈉使?jié)舛冗_到0.06mol·L-1，240～300r/min攪拌30分鐘，得反膠束提取液。
13）酸性水蛭素溶液加入2倍體積反膠束提取液，240～300r/min攪拌30分鐘。
14）4000～4500r/min離心30分鐘，取上相。
15）上相溶液加入1.5～2倍體積pH9.4的生理鹽水，240～300r/min攪拌30分鐘。
16）4000～4500r/min離心30分鐘取下相，加2.8～3倍無水乙醇混合均勻，冷藏過夜。
17）4000～4500r/min離心30分鐘取沉淀得水蛭素。
【主要參考資料】
[1] 張和韡, 王麗萍. 水蛭素的研究進展[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志, 2013, 14(1): 76-78.
[2] 毛全高. 水蛭素劑型研究進展[J]. 安徽醫(yī)藥, 2015, 19(12): 2250-2254.
[3] 嚴(yán)令耕, 黃臣虎, 陸茵, 等. 水蛭素抗凝血和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進展[J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2010, 21(6): 667-670.
[4] 趙恒利, 崔晞, 郭瑞臣. 水蛭素基礎(chǔ)及臨床研究發(fā)展?fàn)顩r[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2006, 41(5): 321-324.
[5] 陳華友, 黃靜, 蔣芝君, 等. 抗凝良藥水蛭素的研究進展[J]. 生物學(xué)通報, 2003, 38(3): 3-5.
[6] 苗艷麗;宋文東;王宏波;方富永. 一種水蛭素的雙水相-反膠束提取法.
CN101759802，申請日2009-11-27.