背景及概述[1][2]
水蛭 (Leech)，俗稱螞蟥，屬環(huán)節(jié)動物門蛭綱，體型呈扁平紡錘形。水蛭人藥在我國最早記載 于 2000 多年前東漢時期的藥物學 專著《神農本草經》，我國中醫(yī)認為水蛭具有破血逐淤通經的功效，主要于治療血瘀經閉、瘢瘕痞塊、跌打損傷。水蛭素 (H irudin) 是水蛭 的活性成分。1884 年，英國威爾士國家醫(yī)學院的?？死蛱?H aycraf t) 博士首先發(fā)現醫(yī)蛭咽部具有抗 熱的水溶性抗凝血物質。1904 年，英國科學家雅各比(Jacoby) 成功地把這種抗凝 血有效成分分離出來，并命名為“水蛭素”。
蛭是活血化瘀類動物藥材的代表藥，應用于臨床已有悠久歷史，可明顯改善血瘀成功提取并廣泛應用于臨床，量效關系明確，與肝素、阿司匹林等傳統(tǒng)的抗凝藥物相比，水蛭素用量小，療效高，不良反應少而輕，重組水蛭素已成為一種新型的抗凝、防栓藥物。然而，由于臨床應用重組水蛭素還存在一定的風險，如產生免疫原性及出血危險等；而且，作為抗凝血酶藥物，重組水蛭素預防動脈血栓的效果并不理想。對其進行分子修飾，以期延長半衰期、降低出血風險已成為研究的熱點。
結構
天然水蛭素是一條含 65 或 66 個氨 基酸殘基組成的單鏈多肽，分子質量為 7 kD，其 N 末端有 3 對二硫鍵(Cys6-Cysl4，Cysl6-Cys28，Cys32 -Cys39 )，使肽鏈繞疊成密集形核心環(huán)肽結構，對蛋白結構起穩(wěn)定作用。其 N 末端含活性中心，能識別底物-凝血酶堿性氨基酸富集位點，并與之結合。
C末端富含酸性氨基酸殘基，最后 9 個氨基酸 中有 6 個為酸性氨基酸。天然水蛭素第 63 位的酪氨酸殘基被硫酸化，而重組水蛭素沒有這個特殊的結構，因此后者抗凝 比活性有所下降。水蛭素肽鏈中部有一個由Pro-Lys -Pm 組成的特殊序列，不被一般蛋白酶降解，這有助于維持水蛭素分子的穩(wěn)定性。
應用[1]
1. 心腦血管疾病
隨著介入心臟病學突飛猛進的發(fā)展，藥物洗脫支架(drug —eluting stent，D ES ) 的出現使冠心病支架置入術后支架內再狹窄的發(fā)生率降低至 10％，然而涂層藥物降低支架再狹窄率的同時，也影響到內皮細胞的愈合而導致血管內皮化延遲，進而激活血小板、活化凝血酶，增加晚期致命性支架內血栓形成的風險。
任曉霞等 通過觀察水蛭素對體外培養(yǎng)的兔血管內皮細胞及平滑肌細胞生長的影響，認為中等濃度水蛭素與現有藥物支架涂層藥物復合使用既可以預防支架內再狹窄，又可以通過抑制凝血酶作用而發(fā)揮預防晚期支架 內血栓 的風險
2. 急性彌漫性血管內凝血(DIC )
用 48 只家兔 D IC 模型進行重組水蛭素抗 D IC 的研究，結果表明，重組水蛭素有強抗 DIC 作用，并呈明顯劑量依賴關系，其抗 D IC 的有效劑量低，作用強度為肝素的 2 倍以上。24 例男性健康志愿者靜脈注射脂多糖(LPS )2 m g/kg，誘發(fā) DIC，隨后分為實驗組與對照組進行，治療結果顯示，對照組凝血酶一抗凝血酶Ⅲ復合物(TAT ) 和D-D二聚體明顯高于實驗組，提示水蛭素有治療 DIC 功效 。
3. 皮膚瘢痕
通過觀察水蛭素對皮膚增生性瘢痕成纖維細胞 bF-GF 及 TGFp 表達的影響，表明水蛭素可下調TG m RNA 和蛋白水平表達，同時上調 bFGF 的 mRNA 和蛋白水平表達，作用呈劑量依賴性，水蛭素對瘢痕有治療效果。通過觀察不同濃度水蛭素對體外培養(yǎng) H SFb 的影響，表明水蛭素對H SFb 的增殖有抑制作用，水蛭素能增加 Bax 表達，抑制 Bcl-2表達，實驗濃度水蛭素對 HSFb 有顯著的抑制作用。
4. 腎臟疾病
重組水蛭素能夠減少 腎小球內纖維蛋白相關抗原沉積，減輕腎小球系膜細胞增殖和腎小球硬化，減輕蛋白尿和低蛋白血癥，改善腎功能。研究證實，轉化生長因子-B(TGF -B1) 表達增加與細胞外基質(ECM )沉積增加相一致，TGF -pB1是腎小球硬化的主要介質。水蛭素可顯著抑制 OX-LD L 誘導活化巨噬細胞導致的系膜細胞 TGF-B 和 FNm RN A 表達上調，提示水蛭素可能通過抑制系膜細胞TG F B 和FN 的過度表達而抑制腎硬化的發(fā)生。
劑型研究[1]
目前的新藥研究領域，開發(fā)一個全新的藥物十分困難，研究熱點大都集中在對現有藥物的分子改造或是結構修飾上，同時設法降低毒副作用。針對在臨床應用中所出現的問題，將重組水蛭素類多肽藥物進行各種類型的結構修飾，以期降低良反應。
目前水蛭素的類似物包括 RGD-重組雙功能水蛭素、多功能融合水蛭素、聚乙二醇修飾水蛭素?，F用于臨床的水蛭素注射劑還存在一系列問題：半衰期較短，對純度要求較高，易經腎排泄，經常注射給患者帶來不便。人們正在研究一些非注射給藥途徑，包括肺部、氣管、鼻腔、口腔黏膜、直腸以及口服給藥 。
制備 [4]
方法1：從菲牛蛭活體中提取天然水蛭素的方法。
該發(fā)明是將清洗干凈的菲牛蛭用誘導物質充分喂飽菲牛蛭，然后對菲牛蛭進行擠壓使其分泌出唾液（水蛭素粗品），所采用的誘導物質包括無機鹽、有機酸和濃度較低的無機酸。具體方法是先配置好純凈的混合水溶液，讓菲牛蛭充分吃飽，然后對其進行擠壓，使其分泌出唾液，每隔一周或10天提取一次，每條鮮活菲牛蛭可以反復提取6-7次，每次能提取水蛭素粗品6-7毫升左右。
方法2：從天然水蛭中提取高抗凝活性水蛭素的方法。
該發(fā)明是將氯化鈉、一水乙酰半胱氨酸鹽酸鹽、賴氨酸、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶中的兩種或多種物質進行組合，溶解于去離子水中配制成刺激液。將活體水蛭稱重后置于容器中，按水蛭重量比刺激液體積為1∶1～5倍加入所述刺激液，刺激3小時使水蛭分泌分泌液，分泌液經過16000～20000r/min離心分離得水蛭素粗品，經0.2微米不銹鋼膜微濾，再經10000～3000道爾頓分子量的有機膜超濾，再進行反滲透納濾濃縮，然后按固體比液體的重量體積比為1：6～10加入藥用淀粉調配，經噴霧干燥，得水蛭素成品。
主要參考資料
[1] 張和韡, 王麗萍. 水蛭素的研究進展[J]. 中國中西醫(yī)結合腎病雜志, 2013, 14(1): 76-78.
[2] 胡哲, 張靜. 水蛭素的應用研究進展[J]. 包頭醫(yī)學院學報, 2014, 30(3): 152-154.
[3] 黃勝, 熊偉, 姚俊杰, 等. 水蛭素提取純化研究進展[J]. 中國生化藥物雜志, 2017, 37(02): 313-315.
[4] 周維官;劉晶;吳玉琴. 一種吸血水蛭活體多次提取天然水蛭素方法. CN201210493449.7，申請日20121128