背景及概述^[1]

醋酸地加瑞克(地加瑞克 acetate)是治療前列腺癌的主要用藥之一，目前主要通過固相合成得到地加瑞克，然后進(jìn)行醋酸轉(zhuǎn)鹽形成醋酸地加瑞克。地加瑞克結(jié)構(gòu)為Ac-D-2Nal-D-Phe(4-Cl)-D-Ala(3-Pyridy)-Ser-Aph(Hor)-D-Aph(Cbm)-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2.。地加瑞克的傳統(tǒng)固相合成方法如下：通過固相合成載體進(jìn)行逐個(gè)的氨基酸合成。然而，該方法中Aph(Hor)重復(fù)與堿接觸，導(dǎo)致二氫尿嘧啶部分轉(zhuǎn)化為乙內(nèi)酰，導(dǎo)致副反應(yīng)發(fā)生。專利公開的地加瑞克合成方法中，6位氨基酸殘基D-4-Aph(Cbm)在合成中采用了側(cè)鏈Cbm基團(tuán)不保護(hù)的Fmoc-D-4-Aph(Cbm)-OH或者側(cè)鏈Cbm用t-Bu保護(hù)的Fmoc-D-4-Aph(t-Bu-Cbm)-OH。然而，固相合成中采用側(cè)鏈不保護(hù)的Fmoc-D-4-Aph(Cbm)-OH，如果反應(yīng)溫度控制不當(dāng)，在最后的乙酰化封端過程中容易產(chǎn)生在側(cè)鏈Cbm基因上的乙?；碑a(chǎn)物，該副產(chǎn)物難以分離純化，將影響工藝的效率和產(chǎn)品的質(zhì)量。采用側(cè)鏈用叔丁基保護(hù)的Fmoc-D-4-Aph(t-Bu-Cbm)，在完成連結(jié)后需要去除保護(hù)基，而Aph(t-Bu-Cbm)側(cè)鏈上叔丁基的脫除比較困難，需要在強(qiáng)酸水溶液中加熱條件下才能完全脫除，加大了產(chǎn)生消旋等雜質(zhì)的可能性，影響產(chǎn)品質(zhì)量。另外還有一些固相片段合成方法用以合成地加瑞克，然而，固相片段縮合投入的每個(gè)片段都是2倍過量，嚴(yán)重浪費(fèi)肽片段，造成合成成本過高。同時(shí)，因固相片段縮合的樹脂取代值限制，物料通量降低，浪費(fèi)溶劑，產(chǎn)生大量廢液。

應(yīng)用^[1]

醋酸地加瑞克是丹麥輝凌制藥有限公司研發(fā)的促性腺激素釋放激素(GnRH)受體抑制劑類藥物，可逆性抑制垂體GnRH受體來減少促性腺激素釋放繼而抑制睪酮的釋放。本品通過抑制對(duì)前列腺癌持續(xù)生長至關(guān)重要的睪酮來延緩前列腺癌的生長和惡化。以激素治療前列腺癌來降低睪酮濃度的初期卻造成睪酮濃度激增，此初始刺激該激素受體可暫時(shí)性促進(jìn)腫瘤生長而不是抑制它，而地加瑞克則不會(huì)。美國FDA于2008年12月批準(zhǔn)地加瑞克上市，主要針對(duì)晚期前列腺癌患者，通過抑制睪丸激素來延緩前列腺癌的病程發(fā)展。 

藥動(dòng)學(xué)及新劑型的研究^[2]

在一項(xiàng)對(duì)地加瑞克藥動(dòng)學(xué)的研究中， 以雄性小獵犬為研究對(duì)象， 評(píng)估了皮下注射與肌內(nèi)注射兩種給藥方法地加瑞克的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)， 并且研究了不同的給藥劑量(0.25 ～ 1.5 mg·kg-1)與濃度(1.25 ～ 40mg·mL-1 )對(duì)藥物吸收的影響。結(jié)果表明， 皮下注射與肌內(nèi)注射給藥后， 藥物血漿濃度與時(shí)間的關(guān)系符合二室模型， 分為兩階段， 最開始是一個(gè)快的一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程， 血漿中藥物濃度水平快速增加， 而后則是一個(gè)慢的一級(jí)動(dòng)力學(xué)過程， 慢的吸收過程半衰期為268 h(約11 d)， 肌內(nèi)注射與皮下注射相比， 肌內(nèi)注射達(dá)峰時(shí)間更快， 兩種給藥方法達(dá)峰時(shí)間分別為2.0 h和3.7 h， 平均最高峰值分別為64 和31 ng·mL-1 。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)， 當(dāng)藥物濃度從1.25 ng·mL-1增加到40 mg· mL-1時(shí)， 藥物的吸收量減少大約50%， 吸收速率也降低。有學(xué)者推測(cè)在給予地加瑞克后， 藥物與注射部位組織蛋白相互作用， 在注射部位形成膠體結(jié)構(gòu)樣的蓄積池， 這種結(jié)構(gòu)可以延長藥物作用時(shí)間， 使藥物血藥濃度長期維持在有效水平。已有實(shí)驗(yàn)證明， 與其他GnRH拮抗劑(如abarelix， ganirelix， cetrorelix)相比， 地加瑞克具有更長作用時(shí)間及低的組胺反應(yīng)。為了獲得更長的作用時(shí)間， 研究者也在嘗試開發(fā)新的劑型， 如亮丙瑞林(leuprorelin)的載體微粒已經(jīng)上市。而最近對(duì)地加瑞克新劑型的開發(fā)研究又有了進(jìn)展， 即將地加瑞克摻合進(jìn)入poly(DL-lactide-co-glycolide)(PLGA)載體， 經(jīng)過噴霧干燥形成新的地加瑞克-PLGA微粒， 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明這種地加瑞克-PLGA微粒與地加瑞克比較， 在相同劑量下， 能夠延長1周的作用時(shí)間。前列腺癌的藥物去勢(shì)治療， 要求藥物具有長的作用時(shí)間， 這樣可以使Ts長期抑制在適當(dāng)水平。早期的GnRH拮抗劑(如Nal-Glu)由于作用時(shí)間短需要每天皮下注射， 這樣在注射部位引起組胺反應(yīng)， 并且由于藥物水溶性的限制， 導(dǎo)致注射部位的硬結(jié)形成， 限制了它的使用。而新一代的GnRH拮抗劑從分子結(jié)構(gòu)上及劑型上都進(jìn)行了較大的改進(jìn)，使作用時(shí)間顯著延長， 不需每天給藥， 并且組胺反應(yīng)也減少甚至消失。

制備^[3]

合成醋酸地加瑞克，具體工藝如下：

1）六肽樹脂片段III的合成：反應(yīng)柱中依次加入取代度為0.68mmol/g的Reink amide MBHA樹脂100g，使用DMF溶脹30min后抽濾除去溶劑，然后在反應(yīng)柱中加入20wt％哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)，反應(yīng)30min后濾除溶液，樹脂使用DMF洗滌六遍。四口瓶中加入42.3g Fmoc-D-Ala-OH(136mmol)，19.3g Oxymapure(136mmol)，控溫0～5℃加入17.2g DIC(136mmol)活化氨基酸5～10min?；罨蟮娜芤恨D(zhuǎn)移至多肽反應(yīng)釜中用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)，控溫20～25℃反應(yīng)2h后使用茚三酮顯色法進(jìn)行反應(yīng)跟蹤，樹脂無色透明則反應(yīng)完全，樹脂顆粒顯色則未反應(yīng)完全，需要延長反應(yīng)直至樹脂無色透明。重復(fù)上述脫保護(hù)步驟及縮合步驟按照肽鏈順序分別縮合連接Fmoc-Pro-OH，F(xiàn)moc-iLys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-D-Aph(Cbm)-OH，F(xiàn)moc-Aph(Hor)-OH，得到六肽樹脂片段III。

2）四肽片段II的合成：反應(yīng)柱中依次加入取代度為1.15mmol/g的CTC樹脂85g，使用DMF溶脹30min后抽濾除去溶劑，四口瓶加入112.4g Fmoc-Ser(tBu)-OH(293.2mmol)，DMF 850ml溶解氨基酸，加入DIPEA 75.8g(586.4mmol)攪拌10min后體系轉(zhuǎn)移至多肽反應(yīng)柱中用氮?dú)夤呐莘磻?yīng)2h后濾除反應(yīng)液。DMF洗滌樹脂6次，然后反應(yīng)柱依次加入DMF，甲醇(85ml)，DIPEA 75.8g(586.4mmol)?？販?0～25℃反應(yīng)2h以對(duì)剩余的活性位點(diǎn)進(jìn)行封端，反完畢后DMF洗滌樹脂6遍，甲醇二氯甲烷交替洗滌收縮樹脂。得到Fmoc-Ser(tBu)-CTC resin樹脂120g，取代度0.80mmol/g。稱取120g取代度為0.80mmol/g的Fmoc-Ser(tBu)-CTC resin樹脂(96mmol)加入固相反應(yīng)器中，用DMF溶脹30min后抽濾除去DMF，然后反應(yīng)柱中加入20wt％哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)，反應(yīng)30min后濾除溶液，樹脂使用DMF洗滌六遍。稱取Fmoc-3-(3-pyridy)-D-Ala-OH(74.6g，192.1mmol)，Oxymapure(27.3g，192.1mmol)加入DMF溶解，控溫0～5℃加入DIC(24.2g，191.6mmol)，加畢攪拌5～10min后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)2h后使用茚三酮顯色法進(jìn)行反應(yīng)跟蹤，直至樹脂無色透明則反應(yīng)完全。重復(fù)上述脫保護(hù)步驟及縮合步驟按照肽鏈順序分別縮合連接Fmoc-D-Phe(4-Cl)-OH和Fmoc-D-2Nal-OH。連接完肽鏈后，繼續(xù)加入20wt％哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)，反應(yīng)30min后濾除溶液，樹脂使用DMF洗滌六遍。其次，加入乙酸酐/DIPEA＝3：6(eq)反應(yīng)1h進(jìn)行封端反應(yīng)。反應(yīng)完，用甲醇/二氯甲烷收縮樹脂并干燥，得到四肽樹脂片段I。使用0.5wt％TFA/DCM溶液對(duì)四肽樹脂片段I進(jìn)行切割反應(yīng)2h，濾液濃縮后使用甲基叔丁基醚逼晶，過濾，得到四肽片段II，共計(jì)66.6g，收率95％。

3）全肽樹脂的合成：向反應(yīng)柱的六肽樹脂片段III中加入20wt％哌啶的DMF溶液進(jìn)行Fmoc脫保護(hù)，反應(yīng)30min后濾除溶液，樹脂使用DMF洗滌六遍。稱取四肽片段II(59.6g，1.2eq)，加入DMF溶解，控溫20～25℃加入MYMsA(10.85g，1.2eq)活化四肽片段II形成活性中間體，加畢攪拌2～3h后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)柱進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)2h后使用茚三酮顯色法進(jìn)行反應(yīng)跟蹤，樹脂有顏色則繼續(xù)反應(yīng)。無色透明則反應(yīng)完全。反應(yīng)完畢后抽去溶劑，樹脂使用DMF洗滌6遍。樹脂使用甲醇與二氯甲烷交替洗滌收縮，收縮完畢氮?dú)獯祾吆媪现梁阒睾笫樟?，得到全肽樹脂?/p>

4）地加瑞克粗產(chǎn)物的制備：連接完畢的全肽樹脂使用95vol％TFA/5vol％H2O比例切割液反應(yīng)3～5h，濾液濃縮后使用甲基叔丁基醚逼晶，過濾，得到終產(chǎn)品104.3g，粗肽收率94％，純度95％。

5）純化、轉(zhuǎn)鹽：采用反向液相色譜法純化：用AQ的填料，A相：0.05wt％TFA的水溶液；B相：0.05wt％TFA的乙腈溶液制備純化，轉(zhuǎn)鹽使用1wt％AcOH的水溶液與乙腈作為流動(dòng)相梯度洗脫后凍干，得到最終產(chǎn)品醋酸地加瑞克。HPLC測(cè)純度，純度為99.94％，單雜含量為0.06％，＜0.1％。醋酸地加瑞克的總收率為80.8％。

主要參考資料

[1] CN201910748640.3 醋酸地加瑞克的合成方法

[2] 治療前列腺癌的新型GnRH拮抗劑地加瑞克

[3] CN201910614837.8 一種合成醋酸地加瑞克的方法