摘要：在研究霉酚酸和利巴韋林抑制丙型肝炎病毒(HCV)感染的機(jī)制過(guò)程中，作者觀察到鳥(niǎo)苷(Gua)對(duì)HCV的抑制作用。在本文，研究人員發(fā)現(xiàn)四種核苷中，僅GUA抑制HCV在人肝癌細(xì)胞中的復(fù)制。GUA并不直接抑制NS5B的聚合酶活性，但改變了胞內(nèi)核苷二磷酸(NDPs)和三磷酸(NTPS)的水平，導(dǎo)致HCV RNA復(fù)制不足，減少了傳染性子代病毒的產(chǎn)生。NTPs或NDPs濃度的變化改變了NS5B RNA聚合酶的體外活性，影響從頭合成RNA和模板切換。此外，GUA介導(dǎo)的這種變化與病毒RNA中INDELs數(shù)量的顯著增加有關(guān)，這可能是病毒后代特異性感染性降低的原因，表明存在有缺陷的病毒基因組。因此，適當(dāng)?shù)腘TP：NDP平衡對(duì)于確保HCV聚合酶的保真度和程度減少基因組缺陷的產(chǎn)生至關(guān)重要。
全文地址：https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1010210
簡(jiǎn)要內(nèi)容：
1.核糖核苷對(duì)HCV復(fù)制的影響
HCV在GUA處理的Huh-7.5細(xì)胞上傳代，其傳染性持續(xù)下降(圖1A和1B)，但在ADE、Cyt或URI存在的情況下，病毒可以持續(xù)復(fù)制(圖1C和1D)。因此，GUA是唯一具有抗病毒活性且無(wú)細(xì)胞毒性的核苷。由于病毒對(duì)細(xì)胞的適應(yīng)性可能影響病毒對(duì)抗病毒藥物的應(yīng)答，作者將HCV在Huh-7.5細(xì)胞上傳代100次，以研究高適合性的HCV對(duì)Gua的反應(yīng)，結(jié)果表明，丙型肝炎病毒P100對(duì)Gua的耐藥性增加。
Fig1.核糖核苷對(duì)HCV復(fù)制的影響
2.鳥(niǎo)苷對(duì)丙型肝炎病毒NS5B活性的影響
為分析GUA抑制HCV復(fù)制的機(jī)制，作者體外測(cè)試了GUA濃度增加對(duì)HCV聚合酶活性的影響。當(dāng)GUA濃度達(dá)到500μM時(shí)，NS5B聚合酶活性增加，即使在1mM的GUA濃度下，NS5B聚合酶活性也與無(wú)GUA處理時(shí)相近。只有在非常高的GUA濃度(10 MM)時(shí)，RNA聚合酶活性才顯著降低(圖4A)。使用19-mer寡核苷酸LE19(圖4B)也得到了類(lèi)似的結(jié)果。因此，GUA對(duì)HCV產(chǎn)生的抑制不能歸因于其對(duì)RNA聚合酶的直接抑制。
Fig4. 鳥(niǎo)苷對(duì)丙型肝炎病毒NS5B活性的影響
3.鳥(niǎo)苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)核苷酸池的影響
為探討該抑制作用是否與胞內(nèi)核糖核苷二磷酸/三磷酸的變化有關(guān)，作者測(cè)定了ADE、Cyt、GUA或URI作用72h后，HUH-7.5細(xì)胞中NTP和NDP的水平，都引起了核苷二磷酸/三磷酸濃度的增加(圖5)。然而，只有URI和GUA分別誘導(dǎo)了UTP和GTP的增加，其中GUA引起的變化最為顯著(圖5A)，細(xì)胞內(nèi)NDP濃度如圖5B所示。
Fig5.鳥(niǎo)苷對(duì)細(xì)胞內(nèi)核苷酸池的影響
4.核苷二磷酸/三磷酸失衡對(duì)體外 HCV NS5B活性的影響
為探索核苷酸濃度的變化是否會(huì)影響病毒聚合酶的活性，作者使用重組NS5BΔ21在NTP或NDP濃度增加的情況下的進(jìn)行了體外RNA聚合實(shí)驗(yàn)。在相應(yīng)的核苷三磷酸濃度增加的情況下，測(cè)量了從頭合成(DN)、引物延伸(PE)和模板切換(TS)聚合酶的活性(圖8)。1 mM的高UTP濃度輕微但顯著地降低了引物延伸活性(圖8A)。然而，NTP濃度的主要影響RNA的從頭合成，其在高ATP濃度下顯著下降(圖8B)，在高GTP濃度下顯著增加(圖8C)。從頭RNA合成的增強(qiáng)伴隨著模板切換的增加(圖8C)。
由于增加GUA濃度會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)NDP濃度(圖5)，作者研究了增加NDP濃度是否影響NS5B RNA聚合酶的體外活性。在固定的核苷三磷酸濃度下，增加相應(yīng)的核苷二磷酸濃度，并測(cè)量了DN、PE、TS的活性(圖9)。NDP的主要影響RNA從頭合成，其在高濃度的ADP和GDP情況下顯著減弱。在引物延伸和模板切換方面則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖9)。
Fig8. 核苷三磷酸的濃度對(duì)NS5B RNA聚合酶活性的影響
Fig9. NDP對(duì)NS5BΔ21 RNA聚合酶活性的影響。
來(lái)源：顧俊 CaoLab